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研究背景

腫瘤免疫治療因其療效高、副作用小，近年來在臨床試驗中得到廣泛研究。然而，免疫反應(yīng)制劑通常需要高劑量以確保免疫治療效果，這不可避免的會引起全身免疫激活等一系列副作用；近年來，許多科研工作者嘗試采用納米系統(tǒng)用于免疫反應(yīng)制劑的遞送。但是，用于構(gòu)建納米系統(tǒng)的無機類載體的安全性和毒性仍然存在一些需要克服的挑戰(zhàn)。因此，為促使納米輸送系統(tǒng)相關(guān)研究盡快走向臨床轉(zhuǎn)化，使用臨床批準的材料可能是未來各種腫瘤模型的可行選擇。

Artificial Nanoscale Erythrocytes from Clinically Relevant Compounds for Enhancing Cancer ImmunotherapyWenquan Ou, Kang Sik Nam, Dae Hoon Park, Jungho Hwang*, Sae Kwang Ku, Chul Soon Yong, Jong Oh Kim*, Jeong Hoon Byeon*Nano‑Micro Lett.(2020) 12:90https://doi.org/10.1007/s40820‑020‑00428‑y

本文亮點

1. 設(shè)計了一種兩相同軸電噴霧法制備紫杉醇負載的假血細胞微粒。2. 聯(lián)合抗程序性死亡配體1抗體(Eu-FBCP/PTX+aPL)可進一步提高化療免疫療效。

內(nèi)容簡介

目前，臨床批準的聚合物藥用樹脂-聚丙烯酸樹脂(Eudragit®[Eu])作為仿生納米系統(tǒng)，可有效地攜帶抗程序性死亡配體(PD-L1)的抗體(aPL)。本研究開發(fā)了一種氣-液兩相電噴霧，在噴霧的機械參數(shù)和電氣參數(shù)平衡的情況下，可以連續(xù)產(chǎn)生僅由臨床相關(guān)化合物組成的仿生納米系統(tǒng)[負載紫杉醇的假血細胞聚丙烯酸樹脂(Eu)顆粒(Eu-FBCP/PTX)]，此系統(tǒng)為實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的化學(xué)-免疫治療納米系統(tǒng)的發(fā)展提供了一個概念上的飛躍。Eu-FBCP/PTX納米系統(tǒng)表現(xiàn)出吞噬和大胞飲的細胞攝取行為；在沒有和存在抗PD-L1抗體的情況下，比類似大小的負載PTX的球形Eu顆粒(Eu-s/PTX)在化學(xué)-免疫治療中具有更好的療效。

圖文導(dǎo)讀

I 制備和表征

采用氣泡壓縮法生成Eu-FBCP/PTX的凹面結(jié)構(gòu)。所設(shè)計的兩相電噴霧成功地制備了凹形結(jié)構(gòu)，這意味著干燥Eu溶質(zhì)的氣泡壓制可以克服粘性力和表面張力(最好形成球形)而產(chǎn)生各向異性形狀。用Cy5.5標(biāo)記的納米系統(tǒng)孵育MC-38和B16BL/6腫瘤細胞，來檢測Eu-FBCP/Cy5.5和Eu-s/Cy5.5之間的細胞攝取差異。結(jié)果顯示，Cy5.5標(biāo)記的Eu(RL)納米系統(tǒng)在MC-38和B16BL/6細胞中的細胞攝取量均顯著低于Eu-FBCP/Cy5.5或Eu-s/Cy5.5的細胞攝取量。Eu-FBCP/PTX的粒徑平均為320.8nm。Eu-FBCP/PTX納米系統(tǒng)在48小時內(nèi)的分散具有時間依賴的緩釋特性(匹配HIGUCHI模型)。

圖1.空氣(內(nèi)噴嘴)-液體(外噴嘴；乙醇中的Eu/PTX)兩相電噴霧示意圖。它可以在電(BE)和機械(CaRe)參數(shù)之間的平衡下，利用Eu/PTX熔體在干燥液滴中的氣泡加壓產(chǎn)生凹面(模仿血細胞形狀)顆粒(Eu FBCP/PTX)，用于聯(lián)合抗程序性死亡配體1(PD-L1)抗體(aPL)的化學(xué)免疫治療。使用單相(僅適用于Eu/PTX溶液)電噴霧產(chǎn)生類似大小的球形顆粒(Eu-s/PTX)，以便在不存在aPL的情況下進行比較。

圖2. PTX不存在時Eu-FBCP和Eu-s的表征。a，b Eu-s/Cy5.5和Eu-FBCP/Cy5.5的高、低倍掃描電鏡圖像。通過控制乙醇溶液中Eu的濃度，在不向內(nèi)噴嘴噴射空氣的情況下，制備了尺寸相近的Eu-s/Cy5.5。c-f FACS結(jié)果(n=3；熒光曲線和平均熒光強度[MFI])用于比較電噴霧中添加Cy5.5后Eu-FBCP和Eu-s之間MC-38(c，d)或B16(e，f)細胞的攝取，以檢查Eu-FBCP因凹形而產(chǎn)生更好的攝取。該分析包括Eu-RL，以確認Eu-RS和Eu-RL之間的吸收差異，為選擇Eu-RS提供依據(jù)。g Eu-FBCP/PTX在PBS(嵌入數(shù)字圖像)中的DLS尺寸分布和PDI。h，i Eu-FBCP/PTX的高、低倍掃描電鏡(h)和透射電鏡(i)圖像。j Eu-FBCP/PTX在DW、PBS或RPMI+10%FBS中分散8h后的典型TEM圖像研究不同介質(zhì)的水動力穩(wěn)定性。k在pH6.5或pH7.4(n=3)條件下，從Eu-FBCP/PTX中釋放PTX 48小時。i Eu-FBCP/PTX和Eu-s/PTX以及游離PTX和Eu(RS；電噴霧前)的XRD譜圖，考察并比較Eu和PTX的摻入情況。m 用不同濃度的Eu-FBCP/PTX或Eu-s/PTX(50-400μg mL-1)培養(yǎng)紅細胞8小時后溶血結(jié)果(n=3；**p<0.01 and **p< 0.001)。

II 體外細胞活力與細胞攝取

MTT結(jié)果顯示，Eu-FBCP和Eu-s(在沒有PTX的情況下)均表現(xiàn)出高細胞活性(>95%)，而游離PTX誘導(dǎo)劑量依賴性細胞毒性，顯示出28.4μg mL-1的最大半數(shù)抑制濃度(IC50)。Eu-s/PTX，Eu-FBCP/PTX的最大半數(shù)抑制濃度分別為15.9和9.7μg mL-1，均顯著低于游離的PTX。研究顯示，Eu-FBCP/Cy5.5的細胞攝取較Eu-s/Cy5.5增加了3倍且Eu-FBCP/Cy5.5主要通過吞噬和大胞飲途徑進入細胞。

圖3. Eu-FBCP/PTX處理MC-38細胞的體外生物測定結(jié)果及可能機制。(**p<0.01 and **p<0.001)。a 用Eu-FBCP/PTX或Eu-s/PTX處理MC-38細胞24小時，以及游離PTX和單個Eu-FBCP或Eu-s(n=6)。b，c 比較Eu-FBCP/Cy5.5和Eu-s/Cy5.5細胞攝取的FACS結(jié)果(n=3；熒光譜和MFI)。d，e FACS結(jié)果(n=3；熒光譜和MFI)用于比較不同抑制劑(包括低溫條件)預(yù)處理對Eu-FBCP/Cy5.5細胞攝取的影響。f 不同抑制劑預(yù)處理細胞并隨后與Eu-FBCP/Cy5.5孵育的攝取途徑的機制示意圖。

III 細胞周期與凋亡

Eu-FBCP/PTX誘導(dǎo)85.4%的細胞凋亡(早期和晚期：Q2+Q3)，比Eu-s/PTX誘導(dǎo)的細胞凋亡率高16.8%。線粒體膜電位 (ΔΨm)的喪失是Cyt c從線粒體向胞漿轉(zhuǎn)運的重要標(biāo)志，是凋亡程序的開始。Eu-FBCP/PTX納米系統(tǒng)較其它藥物組有更強的線粒體損傷效果。

圖4. 不同組別的MC-38細胞的體外細胞周期和凋亡分析(1:對照，2:游離PTX，3:Eu-s/PTX，4:Eu-FBCP/PTX)。a 不同處理(1-4)的細胞周期分析結(jié)果。Brdu和PI用于計算細胞周期中每個階段(G1、S或G2/M)的細胞分數(shù)。b，c 使用Annexin V-FITC/PI試劑盒(n=3)對24小時治療(1-4)的凋亡情況和量化數(shù)據(jù)進行分析。d，e 處理24小時后，細胞的 FACS曲線和JC-1染色的量化數(shù)據(jù)顯示(1-4)細胞(n=3)線粒體膜電位的變化。f，g p53、Bcl-2、Bax、Cyt-c、裂解caspase-9和裂解caspase-3在治療細胞(1-4)中的代表性表達。h 基于表達(f, g)的治療細胞(1-4)凋亡的可能機制示意圖。i 處理后活/死細胞實驗的代表性顯微鏡AO/PI染色細胞圖像(1-4)。

IV 免疫原性細胞死亡誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)

PTX可以通過釋放腫瘤抗原，如HMGB1、CRT和ATP，從死亡細胞表面誘導(dǎo)免疫原性細胞死亡(ICD)。HGMB1和CRT的分泌是促使樹突狀細胞(DCs)成熟并引發(fā)ICD的關(guān)鍵因素。用Eu-FBCP/PTX處理細胞后，HMGB1和CRT的表達要遠遠高于Eu-s/PTX組或者游離的PTX組。這些分子作為DC成熟的輔助刺激物，誘導(dǎo)了85.6%的成熟DC，比Eu-s/PTX(63.7%)誘導(dǎo)的成熟DC多21.9%，比游離PTX(42.3%)誘導(dǎo)的成熟DC多2倍以上。這些結(jié)果顯示，Eu-FBCP/PTX處理細胞后能最大限度地提高CRT和HMGB1的表達，促進DCs的成熟和IFN-γ+CD8+T細胞的活化。

圖5. 不同方法處理后，對MC-38細胞進行體外生物測定，以檢測ICD誘導(dǎo)的的DC細胞成熟和CD8+T細胞活化。1:對照組，2:游離PTX，3:Eu-s/PTX和4:Eu-FBCP/PTX)。a 治療組(1-4)HMGB1和CRT的代表性表達，顯示ICD的誘導(dǎo)。b 處理細胞后(1–4)CD11c+–CD86+(作為DC成熟的指標(biāo))通過產(chǎn)生的TAA來識別DC的成熟。c CFSE-IFN-γ檢測CD8+T細胞的增殖和活化。d 處理細胞后(1-4)活化的IFN-γ+CD8+T細胞。

V 體內(nèi)分布

小鼠靜脈注射12h內(nèi)，腫瘤部位的熒光強度逐漸增加，24h后熒光強度開始降低，其中，注射Eu-FBCP/Cy5.5組的腫瘤部位熒光強度是Eu-s/Cy5.5組的1.76倍。

圖6. Eu-FBCP/Cy5.5(或Eu-s/Cy5.5)的體內(nèi)生物分布及不同處理(1:PBS，2:游離PTX，3:Eu-s/PTX，4:Eu-FBCP/PTX，5:aPL，6:Eu-s/PTX+aPL，7:Eu-FBCP/PTX+aPL)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。a 體內(nèi)處理后，使用動物成像系統(tǒng)獲得濃度范圍為1.5625至50.0000微克/毫升的熒光Cy5.5的校準曲線。b 熒光時間影像(0、4、8、12和24小時)檢測Eu-FBCP/Cy5.5和Eu-s/Cy5.5以及游離Cy5.5在靜脈注射后的腫瘤蓄積情況。c 不同時間點的Cy5.5在腫瘤中的分布。d，e 靜脈注射24小時后小鼠主要器官和腫瘤的典型熒光圖像和量化數(shù)據(jù)。f 不同處理方法靜脈注射樹突狀細胞瘤內(nèi)成熟(1-7)(n =6; *p< 0.05,**p< 0.01, and ***p< 0.001)。g 藥物處理后CD4+–CD8+T細胞浸潤到腫瘤微環(huán)境中(1-7)。g，i 藥物處理后腫瘤內(nèi)浸潤CD8+T細胞CD8+–顆粒酶B+和CD8+–IFN-γ+水平圖(1-7)。

VI 體內(nèi)抗腫瘤免疫治療

為了證實Eu-FBCP/PTX納米系統(tǒng)在ICD誘導(dǎo)的免疫治療中的重要作用，進一步構(gòu)建了相關(guān)的體內(nèi)模型，以檢測在aPL不存在和存在的情況下，DCs的成熟和抗腫瘤IFN-γ+CD8+T細胞的活化。實驗結(jié)果顯示，EuFBCP/PTX誘導(dǎo)的ICD可增強aPL的抗腫瘤免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)大量活化的CD8+T細胞對抗MC-38腫瘤。VII 體內(nèi)聯(lián)合抗腫瘤作用受Eu-FBCP/PTX與aPL聯(lián)合激活抗腫瘤免疫反應(yīng)的啟發(fā)，對MC-38荷瘤免疫活性C57BL/6小鼠進行了聯(lián)合治療的療效評價。在沒有aPL的情況下，Eu-FBCP/PTX和Eu-s/PTX可以提高PTX的療效并適度地抑制腫瘤的生長。而Eu-FBCP/PTX + aPL可以顯著地抑制腫瘤的生長，并且給藥后對小鼠的體重基本無影響，較其它實驗組的小鼠的壽命更長，證實了此納米系統(tǒng)較好的療效和生物安全性。進一步的實驗驗證了此系統(tǒng)中，ICD的誘導(dǎo)和抗腫瘤免疫應(yīng)答在治療中的重要作用。

圖7. Eu-FBCP/PTX和Eu-s/PTX在aPL缺乏(誘導(dǎo)化學(xué)ICD)和存在(增強免疫抗腫瘤活性)情況下的體內(nèi)抗腫瘤作用(*p< 0.05, **p<0.01, and ***p <0.001)。a 不同處理(1:PBS、2:游離PTX、3:Eu-s/PTX、4:Eu-FBCP/PTX、5:aPL、6:Eu-s/PTX+aPL和7:Eu-FBCP/PTX+aPL)體內(nèi)抗腫瘤研究的實驗時間表示意圖。b, c從治療小鼠(1-7；每組6只)收集的腫瘤大小和腫瘤最終重量的時間分布。d治療小鼠的存活曲線(1-7；每組10只)。e在從治療小鼠(1-7只，每組6只)獲得的腫瘤切片中，切割的caspase-9、切割的caspase-3、CD8+和腫瘤壞死因子的組織病理學(xué)和免疫組化表達。f用PBS(正常)、IgG抗體(Iso-Ab)、CD4抗體(CD4-Ab)、CD8抗體(CD8-Ab)和CD8+CD4抗體(CD4+CD8-Ab)預(yù)處理后免疫細胞生成，構(gòu)建免疫組化MC-38荷瘤小鼠模型。g, h單獨用Eu-FBCP/PTX+aPL或Eu-FBCP/PTX治療的免疫組化小鼠(每組6只)的腫瘤大小和最終腫瘤重量的時間分布。i單獨用Eu-FBCP/PTX+aPL或Eu-FBCP/PTX治療的免疫復(fù)合小鼠的存活曲線(每組10只)。

圖8. 通過將Eu-FBCP/PTX與aPL結(jié)合，從Eu-FBCP/PTX誘導(dǎo)的ICD中促進療效的可信模型示意圖。Eu-FBCP/PTX通過吞噬和大胞飲作用進入腫瘤細胞釋放PTX，誘導(dǎo)細胞周期G2/M期和內(nèi)源性凋亡。凋亡癌細胞釋放HMGB1和CRT，促進DC成熟和CD8+T細胞活化。Eu-FBCP-PTX誘導(dǎo)的ICD進一步促進了aPL的療效，其仿生性能優(yōu)于Eu-s/PTX。

撰稿：《納微快報》編輯部

編輯：《納微快報》編輯部