韓國國家癌癥中心：納米凝膠增強腫瘤成像和光動力治療效果
研究背景
光動力療法(PDT)已經被成功的應用于癌癥的治療，光動力治療需要光照、氧氣以及光敏感的藥物(如光敏劑)來殺死癌癥細胞。但是，由于光敏劑(PS)的疏水性、腫瘤特異性差以及在正常組織中不必要的光毒性作用，限制了PDT的應用。研究發現PS-復合納米顆粒能夠提高PS的水溶性，延長PS在體內的循環時間，從而增加PS分子在腫瘤的聚積。而聚合物材料往往被作為光敏劑輸送的材料。
Fucoidan‑Based Theranostic Nanogel for Enhancing Imaging and Photodynamic Therapy of CancerMi Hyeon Cho, Yan Li, Pui‑Chi Lo, Hyeri Lee, Yongdoo Choi*Nano-Micro Lett.(2020)12:47https://doi.org/10.1007/s40820-020-0384-8
本文亮點
1一種基于巖藻多糖的治療性納米凝膠，由巖藻多糖主鏈、氧化還原響應的連接鍵和光敏劑組成，能夠激活腫瘤部位的熒光成像，并增強光動力治療的療效，最終誘導癌癥完全死亡。2在納米凝膠平臺上使用巖藻糖膠作為聚合骨架，可以通過P-選擇素結合實現腫瘤靶向性，并通過抑制血管內皮生長因子的結合增強抗腫瘤作用。
內容簡介
本文開發了一種基于巖藻多糖的治療納米凝膠(CFN-gel)，該凝膠由具有一定抗腫瘤作用的巖藻糖膠主鏈、氧化還原響應性的連接鍵和光敏劑Ce6組成，以實現腫瘤部位的可激活近紅外(NIR)熒光成像和增強的光動力療法(PDT)，誘導癌細胞完全死亡。CFN-gel通過P-選擇素靶向和EPR效應，具有抗血管生成和促進腫瘤部位積聚的作用。此外，CFN-gel在全身給藥時無熒光和光毒性。細胞內化后，CFN‑gel的光活性隨著細胞內氧化還原電位的變化而恢復，從而實現腫瘤的選擇性近紅外熒光成像和增強的PDT治療。本表明，巖藻糖膠納米凝膠是一種高效、特異的腫瘤影像學和治療新材料。
圖文導讀
I CFN‑Gel的表征
首先，用鹽酸胱胺對巖藻多糖主鏈的羧酸進行修飾；然后將Ce6結合成氨基端的巖藻聚糖上來制備CFN-gel。根據1H-NMR計算出，每個巖藻多糖主鏈上結合20.3 Ce6光敏劑分子。將Ce6-巖藻聚糖結合物凍干并在水溶液中重新分散后可以自組裝為納米凝膠，其水合粒徑和zeta電位分別為259±59 nm和-22.2 mV。TEM圖像證實了納米凝膠的形成。CFN-gel有明顯的聚集導致熒光淬滅的現象。與含表面活性劑溶液中的CFN-gel相比，PBS溶液中的CFN-gel的熒光強度淬滅了10倍。
圖1 (a)Ce6-巖藻糖膠納米凝膠(CFN-gel)的合成步驟；(b)CFN-gel及其作用方式示意圖。
圖2 CFN-gel(a)水合粒徑的分布；(b)TEM圖像。CFN-gel在含表面活性劑和PBS溶液中在2 μM Ce6當量下的紫外/可見吸收光譜(c)；熒光發射光譜(d)。
II NIR熒光和SOG的氧化還原響應
在細胞內，CFN-gel中的二硫鍵通過氧化還原反應裂解釋放Ce6分子，從而誘導熒光發射和SOG的生成。當用5 mM DTT處理CFN-gel時，其熒光強度較未用DTT或低濃度DTT處理的凝膠提高了4.9倍，說明二硫鍵斷裂后，CFN-凝膠中聚集的Ce6分子可以有效釋放，從而開啟CFN-gel的熒光。采用singlet oxygen sensor green(SOSG)作為單重態氧檢測試劑，對CFN-gel在670 nm光照下的SOG進行分析。5 mM DTT處理后，CFN-gel SOG的生成量較0或5 μM DTT處理的CFN-gel提高了1.9倍。這些數據表明，CFN-gel具有氧化還原響應熒光發射和光毒性。
圖3 熒光信號的氧化還原響應開啟和CFN-gel的單線態氧生成。(a)DTT處理CFN-gel 4 h后的熒光發射光譜；(b)670 nm激光照射下DTT處理的CFN-gel，SOSG熒光隨時間的增加(n=4)。
III CFN-gel的SPR分析
通過SPR分析比較CFN-凝膠與VEGF-165和P-選擇素的結合特性。VEGF-165與巖藻多糖和CFN-gel的平衡解離速率常數(KD)分別為953.0和756.1 nM。P-選擇素與巖藻聚糖和CFN-gel的KD值分別為69.71和718.9 nM。
圖4 表面等離子體共振(SPR)分析。
IV 體外細胞研究
CFN-gel在含血清蛋白的細胞培養基中具有良好的分散穩定性。HT1080腫瘤細胞內吞實驗顯示，CFN-gel被有效地內化到腫瘤細胞中，熒光淬滅的Ce6在細胞內經氧化還原響應釋放后，熒光被激活。CFN-gel的細胞攝取量至少是游離Ce6的18倍。采用CCK-8法比較細胞存活率，探討CFN-gel對HT1080癌細胞的體外治療作用。在沒有光照的情況下，試驗濃度下，游離Ce6處理6h的癌細胞沒有細胞毒性。同樣，在0.1至2.5 μM的濃度下，觀察到CFN-gel處理的癌細胞沒有細胞毒性。隨著CFN-gel濃度從5 μM、10 μM和20 μM增加，細胞活力逐漸下降，分別為88.3%、85.9%和60.2%。CFN-gel處理24小時進一步降低了細胞活性，而游離Ce6在高達10 μM的濃度下處理24小時，腫瘤細胞未顯示任何細胞毒性作用。用CFN-凝膠或游離Ce6在不同濃度下孵育HT1080細胞6h，用670 nm，10 J/cm2的激光照射(劑量率50 mW/cm2)后，繼續孵育24h，結合Ce6的CFN-gel的IC50值約為2.73 μM。相比之下，游離Ce6處理的細胞在光照下沒有治療作用。
圖5 游離Ce6和CFN-gel處理HT1080癌細胞的近紅外熒光圖像(a)；熒光強度的定量分析(b)；不同濃度的游離Ce6和CFN-gel對HT1080細胞的體外暗毒性(c)；在670 nm光照(50 mW/cm2, 10 J/cm2)下的體外光毒性(d)。
V 體內近紅外熒光成像
使用異種移植小鼠腫瘤模型來評估CFN-gel在體內腫瘤成像中的應用。靜脈注射后5分鐘和24小時獲得近紅外熒光圖像(λex=660/20 nm，λem=710/40 nm)。注射后5 min，游離Ce6處理的小鼠全身呈現高熒光強度，而CFN-gel處理的小鼠則呈現低熒光信號。注射后24小時，在游離Ce6處理的小鼠體內觀察到少量熒光信號，說明大部分Ce6從體內清除，而在腫瘤組織中也沒有明顯的游離Ce6積聚。相反，注射后24小時，CFN-gel處理的小鼠仍能在全身觀察到熒光信號，并且腫瘤部位與周圍正常組織有明顯區別。表明了注射的CFN-gel不僅延長了腫瘤組織的血液循環和腫瘤蓄積，而且還使熒光激活，與體外研究結果一致。收集小鼠的主要器官，可以發現CFN‑gel處理的小鼠，其腫瘤部位有很強的熒光。根據HT1080腫瘤切片CD62P染色，還觀察到高P-選擇素表達，說明除EPR效應外，P-選擇素在腫瘤組織中的高表達增強了CFN-gel的腫瘤靶向性。
圖6 選擇性腫瘤成像在異種移植瘤模型中的體內評價。
VI CFN‑Gel的抗腫瘤作用
通過測定HT1080異種移植瘤模型的腫瘤生長率，進一步評價了CFN-gel聯合PDT的抗腫瘤作用。CFN-gel+PDT組與PBS組、游離Ce6+PDT組和CFN-gel組相比，體內治療效果明顯增強。TUNEL實驗證實了CFN-gel和光照的顯著治療效果。可能由于CFN-gel被內化到P-選擇素過度表達的腫瘤血管內皮細胞中并在光照下破壞它們，導致第4組腫瘤切片的CD31染色幾乎看不到血管生成性腫瘤血管。
與PBS對照組相比，單獨使用CFN凝膠的小鼠在第7-10天顯示腫瘤生長延遲，這可能是由于巖藻聚糖本身的抗癌潛力所致。免疫組化染色圖像的定量分析顯示，與PBS組相比，CFN-gel治療組的腫瘤中CD31陽性內皮細胞的數量減少了45.3%(***P<0.001)，說明CFN-gel具有抗血管生成作用。與PBS組相比，CFN-gel治療組的腫瘤中凋亡細胞增加了4.9倍(**P<0.01)，這表明CFN-gel在腫瘤中的累積誘導了抗腫瘤作用。
圖7 CFN-gel聯合PDT體內抗腫瘤活性研究。
VII CFN-gel的體內生物相容性
組織切片H&E染色，主要臟器未見組織病理學異常，小鼠的體重無明顯減輕，說明CFN-gel具有良好的生物相容性。
圖8 CFN-gel的體內生物相容性。(a)第10天從不同治療組收集的主要器官的代表性H&E染色圖像；(b) PBS、游離Ce6和CFN-gel治療組小鼠第10天的血液化學數據(n=4)；(c)不同組小鼠平均體重隨時間的變化。在任何治療組中，均未觀察到明顯的器官、血液生物標記物和體重毒性跡象。
撰稿：《納微快報》編輯部
編輯：《納微快報》編輯部
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