用于糖尿病患者創(chuàng)面修復(fù)的GOD角蛋白水凝膠
糖尿病是以慢性高血糖為特征的最常見的代謝性疾病之一。病人的機(jī)體長期處于高血糖的刺激之下，在經(jīng)歷傷口愈合這一過程時(shí)，創(chuàng)口新生血管形成不良，細(xì)胞的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)不足，往往比血糖正常的個(gè)體的傷口愈合需要更多時(shí)間。角蛋白水凝膠因?yàn)槠鋼碛械慕M織再生能力，在眾多促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的敷料中極具優(yōu)勢。然而，大多數(shù)已報(bào)道的角蛋白水凝膠需要提前成型，很難契合不規(guī)則的創(chuàng)面。因此，開發(fā)兼具有良好生物學(xué)特性和簡單制備工藝的能原位交聯(lián)成型的角蛋白水凝膠仍是糖尿病患者創(chuàng)口愈合敷料研究乃至組織工程領(lǐng)域的一大難題。
針對這一難題，東華大學(xué)的楊光教授團(tuán)隊(duì)提出了他們的解決思路。他們利用葡萄糖氧化酶（GOD）催化創(chuàng)面體液中的葡萄糖氧化產(chǎn)生過氧化氫（H2O2），通過二硫鍵變換策略，在傷口原位成功形成角蛋白水凝膠。該策略不需要應(yīng)用額外的交聯(lián)劑或?qū)堑鞍走M(jìn)行化學(xué)修飾，水凝膠前驅(qū)體可在3分鐘內(nèi)形成角蛋白水凝膠、對不規(guī)則創(chuàng)面實(shí)現(xiàn)良好的填充，并可以作為促血管生成藥物的緩釋載體，加速糖尿病傷口的愈合。相關(guān)成果 “Glucose-Triggered in situ Forming Keratin Hydrogel for the Treatment of Diabetic Wounds”發(fā)表于Acta BioMaterialia雜志上。
1. 角蛋白水凝膠的交聯(lián)策略水凝膠前驅(qū)液由角蛋白、半胱氨酸和GOD組成。其中的半胱氨酸可以裂解角蛋白中固有的分子內(nèi)二硫鍵，從而暴露出巰基；一旦水凝膠前驅(qū)液接觸到創(chuàng)面， GOD則可以催化創(chuàng)面體液中的葡萄糖氧化，以間接溫和的方式產(chǎn)生氧化力較高的H2O2，從而使巰基迅速交聯(lián)形成分子間二硫鍵，在原位形成角蛋白水凝膠（圖1）。
2. 角蛋白水凝膠的制備與表征考慮到糖尿病患者體液中葡萄糖濃度的差異，研究人員檢測了在兩種葡萄糖水平下，GOD濃度對凝膠時(shí)間的影響，發(fā)現(xiàn)凝膠形成時(shí)間與葡萄糖濃度以及GOD濃度成反比，當(dāng)GOD為15 u/mL 時(shí)凝膠形成時(shí)間最短 (圖2A)。為了進(jìn)一步了解角蛋白水凝膠中包括溶脹率、凝膠時(shí)間、流變性能、力學(xué)性能等在內(nèi)的各項(xiàng)參數(shù)，研究人員比較了不同角蛋白含量（10、15、20%）的GOD、O2和H2O2水凝膠的特性。發(fā)現(xiàn)相較于O2以及H2O2水凝膠，各GOD水凝膠均具有較低的溶脹率以及相對較小的孔徑（主要范圍為25 ~ 37μm），而這種微觀結(jié)構(gòu)有望在組織再生過程中支持細(xì)胞浸潤。同時(shí)，在正常小鼠全層皮膚創(chuàng)面模型上進(jìn)行的評估也證明GOD水凝膠可以通過神催化葡萄糖氧化法在原位快速形成角蛋白水凝膠（圖2B）。
接下來，不同方法制備的水凝膠的流變性能以及力學(xué)性能也分別通過振蕩頻率掃描和機(jī)械壓縮試驗(yàn)得到了評估。結(jié)果表明，1）三種水凝膠均具有彈性；2）在同一角蛋白含量下， GOD水凝膠的彈性模量(G’)、抗壓強(qiáng)度以及有效交聯(lián)密度最高，H2O2水凝膠則相反（圖3）。
3. 角蛋白水凝膠藥物控釋能力以及安全性評估研究人員在體外評估了不同方法制備的角蛋白水凝膠的藥物控釋能力以及降解能力。發(fā)現(xiàn)所有的水凝膠均能在體外自行降解，降解速率與水凝膠中二硫鍵交聯(lián)密度成負(fù)相關(guān)。同時(shí)，研究人員將能促進(jìn)皮膚再生血管生成的去鐵胺(DFO) 通過物理混合加載于水凝膠中，發(fā)現(xiàn)水凝膠能控釋藥物且釋放效率與水凝膠的降解效率相關(guān)。進(jìn)一步的細(xì)胞毒性研究則提示GOD水凝膠以及搭載了DFO的GOD水凝膠不影響細(xì)胞的活性與增殖能力（圖4）。
4. GOD角蛋白水凝膠在創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用測試為了評估GOD水凝膠以及負(fù)載DFO的GOD水凝膠的創(chuàng)面愈合能力，水凝膠前體液被注射至糖尿病大鼠的全層切除創(chuàng)面上并在3分鐘內(nèi)形成了角蛋白水凝膠。與對照組（PBS注射）相比，GOD水凝膠加速了創(chuàng)面的愈合并在傷口完全愈合之前完成降解。而搭載了DFO的水凝膠在創(chuàng)面愈合過程中有效地促進(jìn)了血管生成與表皮再生，具有更強(qiáng)的愈合能力。
5. 總結(jié)GOD角蛋白水凝膠應(yīng)用GOD催化人體液中的葡萄糖氧化間接溫和地生成H2O2。這種方法能防止角蛋白中游離硫醇的過度氧化、使水凝膠前體液更易形成二硫鍵交聯(lián)并實(shí)現(xiàn)機(jī)械強(qiáng)化。同時(shí)，GOD角蛋白水凝膠可以在體內(nèi)外降解，并在此基礎(chǔ)上作為藥物庫將促創(chuàng)面修復(fù)藥物有效遞送至創(chuàng)面，從而促進(jìn)創(chuàng)血管生成與創(chuàng)面。由創(chuàng)面體液中的葡萄糖觸發(fā)的水凝膠原位交聯(lián)成型的方式也使其能適應(yīng)不規(guī)則形狀的傷口。這些特性令GOD角蛋白水凝膠在促進(jìn)創(chuàng)面愈合上表現(xiàn)優(yōu)異，有望成為創(chuàng)面愈合治療和其他組織工程應(yīng)用中的冉冉新星。
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