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炎癥是指身體對刺激的機械、生化或免疫介導的適應性反應。然而，過度活躍性炎癥反應是有害的，長時間的炎癥過程不僅會干擾受損組織的修復過程，還會引發一系列級聯反應，這些級聯反應與炎癥細胞持續募集到病變附近并形成局部炎癥細胞因子風暴有關，這兩種情況最終都會阻礙組織修復并加劇退變。可注射水凝膠微球具有延長藥物半衰期，保持局部藥物有效濃度等優點，已在臨床藥物載體應用中表現出了巨大的潛力，但退行性疾病中的局部過度活躍性炎癥可能會影響這一治療效果。

近期，來自蘇州大學第一附屬醫院的陳亮教授、顧勇教授與上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院的崔文國教授團隊合作在Nano Letters雜志上發表了題目為“Modulation of Local Overactive Inflammation via Injectable Hydrogel Microspheres ”的研究性論文，作者通過在甲基丙烯酰化明膠（GelMA）上共價偶聯APETx2并進一步負載髓核細胞來構建可注射的“肽-細胞-水凝膠”微球，既能抑制局部炎性細胞因子風暴，又實現了在體外調節細胞外基質（ECM）的代謝平衡，為過度活躍性炎癥反應下的組織修復與再生提供了一種有效的途徑。

圖1 文章原理圖，在GelMA上偶聯APETx2并進一步負載髓核細胞來構建可注射的“肽-細胞-水凝膠”微球，該微球可抑制局部過度活躍性炎癥并維持ECM穩定。

微流控技術是構建水凝膠微球的理想平臺。它不僅可以同時裝載藥物和細胞，而且操作簡便，通過與活性肽APETx2共價偶聯并進一步攜帶髓核細胞，即可構建出“肽-細胞-水凝膠”凝膠微球。如圖2所示.：通過微流控同步光交聯裝置制備GelMA微球（GM）后清洗并冷凍干燥后制備出多孔GelMA微球；制備APETx2共軛多孔GelMA微球(GA)并負載髓核細胞，在椎間盤（IVD）退變的大鼠模型中注射“肽-細胞-水凝膠”微球(GNA)；“肽-細胞-水凝膠”微球調節了大鼠IVD退變部位的過度活躍性炎癥，并促進髓核細胞增殖與IVD的再生。

圖2 可注射“肽-細胞-水凝膠”微球調節局部過度活躍性炎癥來促進椎間盤再生的示意圖。

凝膠微球通過微流控裝置中的油包水方法形成，并進一步光交聯和冷凍干燥以獲得多孔凝膠微球。如視頻1所示，在顯微鏡下觀察，同軸噴嘴同向剪切制備的凝膠微球分散性好，大小均勻，微球可以順利地穿過微型注射器的針頭，而不會損壞結構。

視頻1 微球順利通過微型注射器的針頭，沒有損壞結構。

為了賦予髓核細胞調節局部過度活躍性炎癥反應的能力，微球表面的羧基被EDC/NHS激活，然后共價連接到APETx2上的氨基殘基上，形成APETx2-GelMA微球（即GA）。接下來，通過圖3的XPS分析和傅里葉變換紅外光譜分析，表明APETx2肽接枝成功且SEM表明GA保留了GM的多孔結構。糖酵解是椎間盤能量供應的主要形式，逐漸積累的乳酸在退行性椎間盤中產生酸性微環境。因此，研究人員通過高效液相色譜法研究了在兩種酸堿度條件下(7.4和6.5)赤霉素的釋放行為，在pH 6.5條件下肽的釋放速率比pH 7.4條件下高，但兩者之間無顯著差異。

圖3 可注射“肽-細胞-水凝膠”微球（GNA）相關的表征。（A、B）SEM觀察GM與GA微球的微觀形貌差異；（C-F）GM與GA微球的XPS分析與傅里葉變換紅外光譜；（G-H）微球接枝FITC-BSA前后的熒光圖像,以及在pH7.4和pH6.5下，GA釋放APETx2的釋放曲線。

此外，在體外酸性環境中，研究人員檢測了相關蛋白和基因的表達水平。如圖4所示，谷氨酸組的ASIC-3蛋白表達受到顯著抑制，與對照組無顯著差異。炎癥細胞因子白介素-1β、白介素-6和腫瘤壞死因子-α，也被APETx2顯著抑制。與此同時，APETx2下調MMP-3和ADAMATS-5的表達，從而減少由NPCs合成的細胞外基質的降解，導致細胞外基質含量的增加，COL2和聚集蛋白聚糖蛋白的高表達也證明了這一點。以上結果表明，APETx2可以抑制ASIC-3的激活，減少酸性環境引起的椎間盤炎性細胞因子風暴。此外，APETx2可逆轉酸性環境下髓核細胞內細胞外基質的合成/分解代謝失衡，導致髓核細胞內細胞外基質沉積增加，抑制椎間盤退變。

圖4 髓核細胞在體外酸性炎癥微環境中7天的蛋白和基因的表達。（A）ASIC-3、炎癥因子、細胞外基質降解酶和細胞外基質蛋白的蛋白質印跡。（B-I）RT-PCR半定量測定ASIC-3、炎癥因子、細胞外基質降解酶的基因表達。

為了研究GNA促進IVD體內再生的作用，研究人員將將富含髓核細胞的GA (GNA)注射到大鼠IVD退變模型中。如圖5影像學結果表明，調節局部炎性微環境或單獨補充髓核細胞可以延緩椎間盤退變，但不能逆轉退變的椎間盤。另一方面，“肽-細胞-水凝膠”微球不僅保持和恢復了髓核細胞中的高含水量，而且在延緩退變過程的同時促進了退變椎間盤的再生。

圖5 動物實驗的影像學數據。(A)大鼠尾椎穿刺模型的建立。(B)第4周和第8周大鼠尾椎骨的代表性x光圖像。（C-E)第4周和第8周各組DHI百分率的變化。(F)大鼠尾椎骨的代表性核磁共振圖像。(G)各組在第4周和第8周的磁共振分級變化。

術后4周和8周收集組織切片做進一步分析，結果如圖6所示：與正常對照組相比，蘇木精伊紅和番紅O-Fast Green染色顯示GNA組椎間盤組織變性和結構性損傷有所改善。此外，在髓核和纖維環之間有清晰和明確的邊界，并且髓核的含量在8周時顯著改善。然而，在DC、GA和GN組中，椎間盤的髓核隨著椎間盤突出而逐漸破裂,髓核和纖維環之間的邊界越來越模糊。這些結果與免疫組織化學染色的進一步研究結果一致。GNA組的COL2含量在第8周完全恢復，而組織學評分顯示GNA組的膠原含量在第4周顯著高于DC、GA和GN組，但低于正常對照組。GNA組膠原含量在第8周恢復，與正常對照組無顯著性差異，表明“肽-細胞-水凝膠”微球具有促進退變椎間盤再生的作用。

圖6 動物實驗的組織學評價。(A)4周和8周大鼠椎間盤的蘇木精-伊紅染色圖像。(B)番紅O-固綠染色。(D-F)COL2免疫組織化學染色。各組第4周和第8周組織學分級的變化。

綜上所述，該研究通過微流控技術制備了與APETx2共價接枝并攜帶髓核細胞的多孔“肽-細胞-水凝膠”微球，并證實了這種新的“肽-細胞-水凝膠”微球除了參與組織再生過程，還可以調節局部過度活躍性性炎癥反應，以維持椎間盤髓核中細胞外基質的合成/分解代謝平衡。這種可注射的“肽-細胞-水凝膠”微球為實現局部過度活躍性性炎癥反應微環境下的組織再生提供了新的思路。