水凝膠組成和結(jié)構(gòu)對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的影響
微凝膠正逐步進(jìn)入組織再生領(lǐng)域，因?yàn)樗鼈兛朔藗鹘y(tǒng)的大塊/宏觀水凝膠存在的問(wèn)題，如細(xì)胞間接觸和細(xì)胞間通訊有限以及擴(kuò)散率低。由于通過(guò)微創(chuàng)手術(shù)可增強(qiáng)質(zhì)轉(zhuǎn)移和注射能力，這些微凝膠正成為一種有前途的骨再生應(yīng)用方法。然而，凝膠基質(zhì)組成如何影響細(xì)胞反應(yīng)和整體組織形成在從整體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為微凝膠結(jié)構(gòu)的理解上仍有很大的差距，針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，來(lái)自澳大利亞莫納什大學(xué)的Jessica E. Frith教授團(tuán)隊(duì)在Biomacromolecules上發(fā)表了題為“Interplay of Hydrogel Composition and Geometry on Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis”的研究性論文。作者制備了單獨(dú)或同時(shí)含有明膠和透明質(zhì)酸（HA）的聚乙二醇基微凝膠，并評(píng)估了水凝膠的組成對(duì)封裝的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）成骨分化的影響（圖1）。
圖1（A）巰基-降冰片烯點(diǎn)擊反應(yīng)示意圖；（B）塊狀水凝膠和微凝膠制備示意圖
首先，作者設(shè)計(jì)了三種不同的含有硫醇功能化PEG （PEG-(SH)2）的水凝膠，并與降冰片功能化明膠（Gel-NB）或降冰片功能化透明質(zhì)酸（HA-NB）或Gel-NB和HA-NB的混合凝膠混合使用。水凝膠的光交聯(lián)動(dòng)力學(xué)通過(guò)原位光流變學(xué)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示，無(wú)論水凝膠組成如何，光暴露的幾秒鐘內(nèi)就能迅速形成凝膠。從壓縮測(cè)試中得到的應(yīng)力-應(yīng)變曲線可知，Gel、Gel:HA和HA水凝膠的壓縮模量分別為5.2、3.3和2.3 kPa，與存儲(chǔ)模量的變化趨勢(shì)相同。這些數(shù)據(jù)表明，水凝膠的硬度呈現(xiàn)出Gel>Gel:HA> HA的趨勢(shì)。由于高含水量的水凝膠往往比含水量少的水凝膠更軟，HA和明膠親水性的差異也可能導(dǎo)致由它們形成的水凝膠的力學(xué)性能的差異（圖2）。
圖2 Gel、Gel:HA和HA塊狀水凝膠的表征
接下來(lái)，作者使用基于移液管的微流體技術(shù)合成Gel、Gel：HA和HA微凝膠。對(duì)微凝膠的大小和分布進(jìn)行了表征。Gel：HA微凝膠與在塊狀水凝膠中觀察到的溶脹一致，都?xì)w因于HA的高親水性（圖3）。
為了了解水凝膠對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性和適宜性，作者測(cè)定了三種水凝膠制劑在大體積和微凝膠狀態(tài)下的體外降解率。與塊狀水凝膠相比，在DPBS中Gel：HA和HA水凝膠的質(zhì)量顯著增加。所有體積水凝膠的凝膠質(zhì)量在10天內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。10天后，觀察到所有水凝膠成分的質(zhì)量逐漸增加，HA 增加的比例更高。同時(shí)微凝膠的降解性能與整體水凝膠有顯著差異。微凝膠與塊狀水凝膠的比表面積的增加增加了傳質(zhì)導(dǎo)致塊狀水凝膠更快的降解，這種效應(yīng)對(duì)于高親水性的HA微凝膠更為明顯，可能是由于較高的溶脹程度（圖4）。
圖4（A）巰基-降冰片烯點(diǎn)擊反應(yīng)示意圖；（B）塊狀水凝膠和微凝膠制備示意圖
為了評(píng)估水凝膠組成和幾何結(jié)構(gòu)在生物學(xué)功能上的相互作用，作者評(píng)估了不同水凝膠組成在塊狀和微凝膠形態(tài)下支持hBMSC培養(yǎng)的能力。將hBMSCs以塊狀和微凝膠的形式封裝，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天和7天后，通過(guò)活/死染色評(píng)估細(xì)胞存活率。包封后24小時(shí)和培養(yǎng)7天，三種成分的塊狀水凝膠和微凝膠的細(xì)胞存活率均超過(guò)85%。HA水凝膠可以歸因于在透明質(zhì)酸單獨(dú)水凝膠中缺乏細(xì)胞黏附和擴(kuò)散，這是錨定依賴細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞生存和生長(zhǎng)所必需的。這些圖像也提供了細(xì)胞分布的初步指示，其中間充質(zhì)干細(xì)胞呈圓形分布在第1天上的微凝膠中，但遷移到微凝膠的外圍并在第7天前擴(kuò)散，從而使熒光更加強(qiáng)烈（圖5）。
圖5 塊狀水凝膠和微凝膠封裝的hBMSCs的細(xì)胞存活率評(píng)估
之后，進(jìn)一步對(duì)hBMSC的擴(kuò)散和細(xì)胞骨架形態(tài)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，Gel和Gel:HA水凝膠中的細(xì)胞分布良好，突出明顯，表明與聚合物基質(zhì)有良好的相互作用和粘附。相反，HA水凝膠中的細(xì)胞保持圓形，可能是由于HA中缺少結(jié)合位點(diǎn)。無(wú)論組成如何，對(duì)于塊狀水凝膠而言，囊化細(xì)胞的分布是均勻的。相比之下，Gel和Gel:HA微凝膠中幾乎所有的囊化細(xì)胞都遷移到微凝膠外周，但這種影響不明顯。作者推測(cè)，這可能是由于細(xì)胞主動(dòng)感知到微凝膠表面更高的傳質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)濃度，從而遷移到表面（圖6）。
圖6 細(xì)胞在塊狀水凝膠和微凝膠中的形態(tài)
為了確定水凝膠組成和幾何形狀對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響，所有組成的體積水凝膠和微凝膠均在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。與基礎(chǔ)培養(yǎng)相比，骨誘導(dǎo)培養(yǎng)中ALP和RUNX2基因表達(dá)明顯上調(diào)，表明hBMSC成功分化為成骨細(xì)胞系。此外，Gel和Gel：HA內(nèi)的hBMSC成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)中ALP和RUNX2的表達(dá)明顯高于2D單層細(xì)胞培養(yǎng)。這強(qiáng)調(diào)了3D平臺(tái)相對(duì)于2D平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)。相反，HA水凝膠不支持成骨。同樣的，與塊狀凝膠相比在微凝膠中ALP表達(dá)也明顯增高（圖7）。
圖7 在2D、塊狀水凝膠以及微凝膠中對(duì)hBMSCs進(jìn)行成骨分化檢測(cè)成骨分化標(biāo)志物
最后，作者為了驗(yàn)證不同的羥基磷灰石對(duì)Gel和HA的親和力是導(dǎo)致礦化差異的原因這一假設(shè)，分別檢測(cè)了羥基磷灰石（HAP）的成核和保留是否受到不同水凝膠組成的影響。通過(guò)將羥基磷灰石納米粒子（200 nM）與無(wú)細(xì)胞微凝膠孵育24小時(shí)，然后洗滌多余的羥基磷灰石納米粒子，測(cè)試了羥基磷灰石對(duì)研究中使用的每種水凝膠的親和力。明場(chǎng)圖像清楚地顯示了微凝膠表面羥基磷灰石沉積的組分差異，其中凝膠微Gel沉積最多，其次是Gel:HA和HA微凝膠。羥基磷灰石與微凝膠表面結(jié)合，通過(guò)骨圖像染色和強(qiáng)度定量進(jìn)一步說(shuō)明，Gel顯示出比Gel：HA和HA更強(qiáng)的熒光。明膠作為膠原的來(lái)源，可能有利于為磷灰石晶體的形成提供成核點(diǎn)，而對(duì)幾種糖胺聚糖的研究表明，HA對(duì)羥基磷灰石的親和力最弱（圖8）。
圖8 羥基磷灰石親和和成核研究分析 在本研究中，作者通過(guò)系統(tǒng)地研究水凝膠組成和幾何結(jié)構(gòu)這兩種因素對(duì)hBMSC包封和成骨的影響，為水凝膠組成和幾何結(jié)構(gòu)之間的相互作用提供了新的見(jiàn)解。作者的研究結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化在很大程度上受到水凝膠組成和幾何形狀的影響。與僅含HA的水凝膠相比，含Gel的水凝膠顯示出良好的細(xì)胞擴(kuò)散和成骨作用。對(duì)于塊狀水凝膠，羥基磷灰石與明膠的結(jié)合增強(qiáng)了成骨分化，但盡管微凝膠的表現(xiàn)通常優(yōu)于整體水凝膠，但在微凝膠中，羥基磷灰石的這種作用是相反的。作者對(duì)水凝膠組成和結(jié)構(gòu)的研究，為以組織工程目的設(shè)計(jì)水凝膠，提供了新型的復(fù)合材料的新思路。
信息來(lái)源: EngineeringForLife
本信息源自互聯(lián)網(wǎng)僅供學(xué)術(shù)交流 如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系我們立即刪除
| 溫馨提示：蘇州北科納米供應(yīng)產(chǎn)品僅用于科研，不能用于人體,不同批次產(chǎn)品規(guī)格性能有差異。網(wǎng)站部分文獻(xiàn)案例圖片源自互聯(lián)網(wǎng)，圖片僅供參考，請(qǐng)以實(shí)物為主，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系我們立即刪除。 |
