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1. 綜述了FLIM聯(lián)合NAD(P)H、FRET和生物傳感器在癌癥診斷和治療監(jiān)測的應用。

2. 介紹了FLIM的原理及其臨床轉(zhuǎn)化發(fā)展歷程。

3. 討論了FLIM技術的不足及未來在癌癥診斷和抗癌治療的應用發(fā)展前景。

內(nèi)容簡介

時間分辨熒光成像顯微鏡(FLIM)在過去的30年里得到了迅速的發(fā)展，并在生物醫(yī)學工程中得到了廣泛的應用。熒光標記探針設計的最新進展進一步拓寬了熒光的應用前景。由于熒光時間對微環(huán)境和分子層面改變更加敏感，故FLIM對疾病的診斷和療效評估極具應用前景。

目前癌癥相關的FLIM應用可分為三大類：(i) FLIM檢測以NAD(P)H為代表的胞內(nèi)或胞外的自發(fā)熒光分子用于細胞代謝研究；(ii) FLIM結合熒光共振能量轉(zhuǎn)移用于蛋白質(zhì)相互作用監(jiān)測；(iii) FLIM結合熒光標記的生物傳感器進行癌癥異常分子檢測。納米材料和熒光時間快速計算技術的進展，以及新的癌癥生物標志物的發(fā)現(xiàn)，促進了FLIM的優(yōu)化，為癌癥診斷和治療的醫(yī)學研究和臨床應用提供了更多的機會。

中南大學劉艷平教授，武明花教授；澳洲悉尼大學Zongwen Liu副教授等在本文中綜述了2015-2020年癌癥相關FLIM應用的前沿研究，討論了FLIM在未來癌癥診斷和抗癌治療的可能性，同時總結了當今FLIM發(fā)展的不足以及未來在癌癥領域的發(fā)展方向。

圖文導讀

I FLIM臨床應用發(fā)展

熒光時間憑借其對微環(huán)境改變敏感等諸多優(yōu)勢在熒光成像領域得到了越來越多的應用，時間分辨熒光技術(FLIM)也隨之發(fā)展。自上個世紀八十年代，第一臺單分子計數(shù)-時間分辨熒光技術(TCSPC-FLIM)被發(fā)明以來，在FLIM成像速度，熒光時間測量準確性，分辨率等方面，F(xiàn)LIM得到了長足的發(fā)展，如雙光子和多光子熒光FLIM技術不但在實驗室層面得到了發(fā)展，也有越來越多的臨床FLIM器械得到研制并逐步走向臨床應用。而在生物醫(yī)學領域，F(xiàn)LIM也在胞內(nèi)離子濃度，蛋白相互作用，皮膚病等多個領域具有發(fā)展?jié)摿Γ�本文則是基于當前癌癥高發(fā)生率和死亡率的現(xiàn)狀，從NAD(P)H自發(fā)熒光，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)以及生物傳感器三個方面系統(tǒng)論述了近五年FLIM在癌癥早期診斷和療效監(jiān)測上的應用。

II FLIM的基本原理

如圖2a所示，當分子被激發(fā)至激發(fā)態(tài)后，它將返回到基態(tài)，而熒光正是分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的一種能量輻射形式。熒光壽命可以被簡單地理解成一個物質(zhì)中所有分子在激發(fā)態(tài)平均的“停留時間”，也可以經(jīng)過精準的熒光強度衰減曲線記錄，將熒光強度從I₀衰減到I₀/e的時間視為熒光壽命。 而在時間分辨熒光顯微鏡(FLIM)的構造方面，圖2b介紹了FLIM是在熒光顯微鏡的基礎框架上融合單光子檢測器和光子計時裝置而進行研發(fā)。基于熒光時間的測量方式，F(xiàn)LIM可以分為時域和頻域兩類，時域中又可分為TCSPC，時間門控和條紋相機三大類，其中TCSPC-FLIM的基本原理如圖2c的示例圖所示，通過光電倍增管的信號放大以及時幅、幅電轉(zhuǎn)換將不同時刻檢測到的光子依據(jù)到達時間構建熒光強度衰減曲線從而得到熒光時間。而頻域FLIM的基本原理則是如圖2d所示，基于對激發(fā)光的調(diào)制和檢測信號的解調(diào)，利用對曲線相移等參數(shù)分析，獲得熒光時間。經(jīng)過儀器測得的熒光衰減曲線，依據(jù)熒光來源于單個或多個熒光分子的區(qū)別可以通過單指數(shù)或多指數(shù)函數(shù)分析計算來分析得到熒光時間。為了規(guī)避上述兩種方法需要提前判斷熒光分子數(shù)目和精確擬合熒光衰減曲線的缺點，相量分析在熒光時間的分析領域方面得到了越來越多的應用。利用公式將FLIM儀器所測得的參數(shù)值轉(zhuǎn)換成繪制相量圖(Phasor Plot)所需的g值和s值，對得到的相量圖進行進一步的分析獲得檢測樣品中熒光分子數(shù)目及各自的熒光時間等信息，并可以此為基礎繪制FLIM圖像。

III FLIM結合NAD(P)H分子的自發(fā)熒光用于癌細胞代謝監(jiān)測

基于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)(NADH，NADPH)和氧化型黃嘌呤二核苷酸(FAD)的自發(fā)熒光特性，以及如圖3b所示的在細胞糖酵解和三羧酸循環(huán)過程以及后續(xù)氧化磷酸化(OXPHOS)過程中NADH、FAD等分子的變化，利用FLIM檢測這些自發(fā)熒光分子熒光時間的變化可以實現(xiàn)對癌細胞胞內(nèi)代謝的監(jiān)測。而在這個部分，依據(jù)直接檢測參數(shù)的不同，又可以分為熒光時間、比值和相量圖以及多參數(shù)FLIM三個部分。

在熒光時間部分，值得先說明的是，在氧化磷酸化過程中由于NADH分子會與輔酶結合而呈現(xiàn)蛋白質(zhì)結合NADH狀態(tài)，NADH分子的熒光時間將會從0.4 ns增長至2 ns。而上個世紀由Warburg提出的Warburg效應又指出癌細胞較正常組織細胞更喜歡在細胞胞質(zhì)內(nèi)利用糖酵解進行能量供應同時抑制通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，故癌細胞中的熒光時間往往短于正常組織細胞，利用這一特性可以實現(xiàn)如圖3a-i所示的腫瘤手術切除邊緣的確定。但最近也有越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，以腫瘤干細胞為代表的腫瘤細胞并不遵守Warburg效應，具體原因還有待探究。

而比值和矢量圖部分則是基于代謝過程中這些自發(fā)熒光分子形式的變化，利用比值放大代謝發(fā)生前后差異，達到靈敏檢測的目的。如圖3a-iii所示，利用糖酵解過程中增高的NADH/NAD+比值和腫瘤細胞的Warburg效應原理，可以幫助確定腫瘤手術切除邊緣。而相量圖則是通過多種自發(fā)熒光分子如彈性蛋白(elastin)，F(xiàn)AD，尤其是游離型和蛋白結合型NADH在代謝過程中的改變導致的熒光時間變化(圖4a)，反應細胞內(nèi)free-NADH/bound-NADH的比值變化，實現(xiàn)在宮頸癌癌前病變(圖3a-ii)、白血病細胞亞型分類(圖4b)等多個臨床領域的應用。

在多參數(shù)FLIM領域內(nèi)，多光譜FLIM(ms-FLIM)用于癌癥的診斷往往集中在口腔癌前病變(圖3a-iv)以及皮膚基底細胞癌等領域。同時，利用計算機對以高斯分布、信息熵以及熒光時間的分析處理，包含熒光時間的多參數(shù)分析處理模型也有望輔助臨床上以基底細胞癌診斷為代表的多種皮膚疾病的診斷分型(圖4c)。

IV FLIM結合熒光共振能量(FRET)技術的應用

如圖5a所示，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)發(fā)生在特定條件下的供體和受體熒光分子之間，利用全反射熒光顯微鏡(TIRF)或者時間分辨熒光顯微鏡(FLIM)可以實現(xiàn)對FRET效率或者供體熒光分子熒光時間衰減的檢測。FRET-FLIM在癌癥領域的檢測應用依據(jù)采取的FRET熒光對的不同類型可以分為五類，熒光對裂解型(cleavage)，結合域型(Binding domain)，蛋白熒光分子標記型(Tag)，二聚物型(Dimer)和底物分子反應型(Substrate)。熒光對裂解型主要針對產(chǎn)生切割效應的蛋白質(zhì)的活性檢測，如圖5b中所示的caspase3的活性檢測。Binding domain型則往往是利用靶標分子與不同底物結合時的構象差異導致的FRET發(fā)生與否的后果，實現(xiàn)對靶標蛋白的活性檢測，如圖5c中所示的RhoA蛋白。利用Tag型則是基于靶標蛋白構象改變導致相連的FRET熒光對的FRET現(xiàn)象變化來實現(xiàn)活性的間接檢測，圖5d針對的目標即是PKB蛋白活性檢測。至于Dimer型熒光分子對結合FLIM的應用多見于在細胞膜或外泌體上會發(fā)生二聚化的受體數(shù)量或活性檢測，如表皮生長因子受體家族HER2，HER3受體就是研究的代表(圖5e)。最后一類底物型基本模式與Tag型很接近，兩者的最大區(qū)別在于Tag型是靶標蛋白自身被激活導致的自身構象改變使得FRET效應發(fā)生變化，而底物型的靶標蛋白是通過使它的目標底物發(fā)生構象變化，而達到目標底物上相連的FRET熒光對的FRET變化，以進行活性檢測(圖5f)。通過對胞內(nèi)或膜上蛋白質(zhì)數(shù)量或者活性的改變從分子水平上達到癌癥診斷或者抗癌治療療效評估的目的，提升癌癥患者的預后。

V FLIM結合熒光標記探針的應用

5.1 胞內(nèi)分子變化FLIM檢測

細胞內(nèi)的分子變化FLIM檢測可以分為核內(nèi)和細胞質(zhì)內(nèi)兩類，在細胞核內(nèi)部分圖6a論述的是結合一種乙酰轉(zhuǎn)移酶活性生物傳感器(HATS)實現(xiàn)對乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的檢測從而輔助針對組蛋白乙酰化的抗癌藥物療效評估。在細胞質(zhì)內(nèi)，F(xiàn)LIM則可以結合新型量子點和熒光標記的香豆素探針實現(xiàn)對細胞質(zhì)內(nèi)兩大代謝情況-糖代謝和脂代謝的監(jiān)測，輔助癌細胞的代謝研究和臨床診治應用(圖6a，c)。

5.2 膜結構變化FLIM檢測

由于FLIM檢測膜上受體變化情況已在FLIM-FRET部分詳細論述，在這一部分主要聚焦于FLIM結合熒光探針檢測細胞膜和線粒體膜的電勢以及膜黏度變化的應用。這些參數(shù)與細胞膜通透性等指標相關，間接反映細胞惡性轉(zhuǎn)化等細胞活動。在膜電勢測量領域，圖7a選擇的代表性研究是利用FLIM檢測VoltageFluor熒光染料標記探針的熒光時間，由于膜去極化時削弱了光誘發(fā)的電子轉(zhuǎn)移，導致從超極化到去極化時檢測到的熒光時間將會延長。而在膜黏度測量領域，熒光探針大多基于圖7b左圖所示的氯化硼絡合二吡絡甲川結構(BODIPY)。如圖7b右圖所示，當膜黏度升高時將會提升從熒光探針從平面構型轉(zhuǎn)換到蝶式構型的能量壁壘，導致激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的非輻射性途徑削弱，從而使得以熒光為代表的能量輻射途徑增強，熒光時間延長。圖7c即是使用BODIPY2探針結合FLIM實現(xiàn)對體內(nèi)CT26腫瘤的FLIM成像，檢測細胞膜黏度。

5.3 腫瘤細胞外環(huán)境FLIM檢測

在腫瘤細胞外環(huán)境中，主要討論了結合熒光探針、量子點等熒光材料是否有望實現(xiàn)對腫瘤微環(huán)境的pH，血管構成以及外泌體進行檢測。使用融合有ECFP熒光蛋白的CBD-ECFP分子可以實現(xiàn)利用熒光時間反映體外基質(zhì)中pH的目的(圖8a)。而腫瘤血管成像則是基于血液中循環(huán)的量子點的長時熒光特性，探究腫瘤組織和正常組織血管形態(tài)差異(圖8b)。而圖8c則是利用膜黏度探針的熒光時間反映外泌體的膜黏度從而得到外泌體大小的信息，有望用于臨床癌癥早期診斷。

5.4 FLIM檢測具有熒光發(fā)射的抗癌藥物遞送

圖9a是利用FLIM探究帶有OG熒光標記的外泌體和微囊泡紫杉醇遞藥方式入胞機制，研究發(fā)現(xiàn)外泌體主要通過胞吞方式入胞，而微囊泡則通過胞吞和與細胞膜融合兩種方式入胞。而在脂質(zhì)體遞藥策略(liposome)研究中，圖9b的研究中使用FLIM探究了體內(nèi)遞送過程中生物分子冠狀物在脂質(zhì)體周圍形成導致載藥泄露的問題。除了前面兩類抗癌藥物遞送策略，近年來以納米結構為基礎的抗癌藥物遞送新策略不斷涌現(xiàn)，一種如圖9c所示的PAH-Cit-Dox的納米遞送策略得到了構建和實驗室研究，使用FLIM得到FLIM相量圖(Phasor plot)和相量區(qū)分的熒光時間像素圖(PDLPI)對阿霉素的釋放和其在細胞內(nèi)的分布進行了監(jiān)測，輔助遞送策略優(yōu)化和療效提升。

VI總結與展望

1. FLIM成像速度，分辨率提升以及與其它光學技術的整合成像。

2. FLIM走向臨床應用在熒光分子生物相容性、靶向性，以及深層次穿透能力如近紅外熒光分子研究仍需進行。

3. FLIM結合NAD(P)H自發(fā)熒光用于代謝檢測可以拓寬至腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞、神經(jīng)元等，輔助腫瘤免疫治療等研究。

4. 利用熒光探針結合FLIM有望實現(xiàn)腫瘤外泌體中RNA檢測，而以阿霉素(Dox)為代表的抗癌藥物遞送也可與外泌體策略結合，使用FLIM監(jiān)測優(yōu)化。