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通過手術(shù)和放射治療等局部治療措施可進(jìn)行早期癌癥診斷，從而使有效治療原發(fā)性腫瘤成為可能。早期診斷主要依靠血液生物標(biāo)記物，然而，大多數(shù)生物標(biāo)記物因從腫瘤中脫落的速度非常低，且被血液循環(huán)嚴(yán)重稀釋以及缺乏特異性等問題阻礙了早期檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。值得注意的是，大多數(shù)人類的非傳染性疾病（如癌癥、炎癥和血栓形成）會對蛋白酶活性產(chǎn)生影響，若將檢測蛋白酶活性作為疾病的生物標(biāo)志物，則有助于避免靈敏度和特異性不足等缺陷，但是檢測蛋白酶活性的工具通常需要依賴于繁瑣的基礎(chǔ)設(shè)施分析，如熒光、質(zhì)譜或磁共振成像，這些技術(shù)在實踐中需要昂貴的分析試劑，且在不同的環(huán)境中通用性較差。因此，為了實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療在全球范圍內(nèi)的普及，就需要開發(fā)簡單、靈敏度高的診斷工具來檢測蛋白酶活性。

為了滿足簡單、靈敏診斷讀數(shù)的需要，超小金納米團(tuán)簇（AuNCs，<2 nm）不僅具有分立的電子和分子性質(zhì)，而且具有類過氧化物酶活性，可以提供催化活性的比色測量。然而，迄今為止，AuNCs僅用于熒光和X射線對比生物成像的活體應(yīng)用，因此，利用AuNCs的催化活性來開發(fā)一個能直接用比色法讀出疾病狀態(tài)的納米傳感器顯得尤為重要。

基于此，麻省理工學(xué)院Sangeeta N. Bhatia教授和倫敦帝國理工學(xué)院Molly M. Stevens教授合作，以生物素化蛋白酶裂解肽為模板，并與中性親和素（NAv，生物相容性載體，對生物素具有高親和力和低特異性的結(jié)合性能）偶聯(lián)，進(jìn)而構(gòu)建了一種多功能蛋白酶響應(yīng)性納米傳感器。當(dāng)經(jīng)尾靜脈注射到結(jié)腸癌小鼠體內(nèi)后，可被腫瘤部位的鋅依賴性基質(zhì)蛋白酶9（MMP9）特異性切割，導(dǎo)致納米傳感器組裝體解體，然后AuNCs（2 nm）經(jīng)腎臟濾入尿液中。由于AuNCs具有擬過氧化物酶活性，其在過氧化氫的存在下可以使TMB產(chǎn)生明顯的顯色反應(yīng)，從而可以通過肉眼判定腫瘤的有無以及嚴(yán)重情況（圖1）。

圖1 納米催化劑信號放大傳感系統(tǒng)的設(shè)計

作者使用三肽谷胱甘肽（GSH, γ-Glu–Cys–Gly）、巰基功能性蛋白酶可裂解肽（P1₁₃/P1₂₀/P2₁₃/P2₂₀（表1））、次氯金酸（HAuCl₄）一鍋法合成了四種多肽功能化的AuNCs（圖2a）。透射電子顯微鏡（TEM）觀察到所得GSH-AuNCs平均粒徑為1.5±0.4 nm，低于腎小球濾過極限（~5.5 nm），說明所得納米團(tuán)簇可能很容易被腎臟清除（圖2b、c）。通過在652 nm處測量底物3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）的吸光度值（A₆₅₂） 來反應(yīng)多肽功能化的AuNCs的擬過氧化物酶活性（圖2d）。為了評估催化探針的靈敏度，作者測量了不同濃度多肽功能化的AuNCs在合成尿液中的催化活性（圖2e），結(jié)果顯示，檢測限（LOD）為~2.7 pmol （尿液25 μl，~100 nM AuNCs），并且線性響應(yīng)范圍寬，動態(tài)范圍超過三個數(shù)量級的顆粒濃度。由于天然辣根過氧化物酶在體內(nèi)容易受到內(nèi)源性蛋白酶的非特異性降解進(jìn)而阻礙其催化活性，然而，GSH-AuNCs和P2₂₀-AuNCs在生理環(huán)境中表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性，同時，在血清和尿液中能保持很高的催化活性（圖2f）。

圖2 多肽功能化的AuNCs具有很高的催化活性

為了確定腎臟清除顆粒的效率，作者通過催化活性分析和電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）對注射多肽功能化的AuNCs小鼠尿液中的金含量進(jìn)行測定（圖3a）。結(jié)果表明，在注射1 h后，尿液中含有73±7%多肽功能化的AuNCs且具有較高的催化活性（圖3b），并且，催化活性和ICP-MS的結(jié)果呈正相關(guān)（圖3c）。因此，利用催化活性的比色活性測定法可以簡單而靈敏地評估尿液中AuNCs的存在，而不需要ICP-MS。

圖3 多肽功能化的AuNCs可被腎臟清除，并在

尿液中保持較高的催化活性

隨后，作者采用熒光相關(guān)光譜（FCS）作為單分子檢測的方法來探究AuNC-NAv復(fù)合物的蛋白裂解動力學(xué)過程（圖4a）。當(dāng)復(fù)合物與MMP9孵育后，觀察到復(fù)合物的擴(kuò)散系數(shù)隨著時間推移向游離熒光標(biāo)記簇的擴(kuò)散系數(shù)移動，這表明復(fù)合物已經(jīng)解體（圖4b）。另外，F(xiàn)CS的流體力學(xué)尺寸分析表明，AuNC-P2₂₀-NAv復(fù)合物與MMP9孵育后在4.5 h內(nèi)完全解體，而當(dāng)與非靶標(biāo)酶——凝血酶（THR）孵育12 h時，AuNC-P2₂₀-NAv復(fù)合物的大小并沒有下降到腎小球濾過極限以下（圖4c），此外，MMP9對AuNC-P2₂₀-NAv復(fù)合物每分鐘的切割速率（3%）是AuNC-P2₁₃-NAv復(fù)合物（0.08%）的40倍，這可能歸咎于P2₂₀肽鏈較長，使得酶對剪切鍵的可及性增加。同時，在第1 h內(nèi)，約80%的AuNC-P2₂₀-NAv復(fù)合物被MMP9孵育切割（圖4d）。綜上所述，本文所設(shè)計的蛋白酶響應(yīng)性納米傳感器對目標(biāo)酶具有特異性，且在目標(biāo)酶的作用下裂解速率很快。

圖4 體外驗證AuNC-NAv復(fù)合物與蛋白酶

孵育后的裂解過程

在體內(nèi)結(jié)腸癌檢測實驗中，荷瘤和健康小鼠均通過尾靜脈注射MMP9響應(yīng)性AuNC-P2₂₀-NAv復(fù)合物（圖5a）。通過直接比色讀數(shù)和收集尿液中清除的AuNC催化活性的初始速度分析（A₆₅₂ min^-1），1h后收集小鼠尿液樣本進(jìn)行催化活性檢測發(fā)現(xiàn)：與健康小鼠相比，荷瘤小鼠的尿液樣本可使底物TMB具有肉眼可見的藍(lán)色（圖5b），攜帶腫瘤的小鼠平均尿信號比健康小鼠增加了約13倍（圖5c）。此外，受試者工作特性分析顯示，曲線下面積為0.91 （圖5d，P=0.0002），說明該比色實驗可區(qū)分結(jié)直腸癌異種移植瘤的存在且準(zhǔn)確度高。為了驗證AuNC-NAv復(fù)合物在體內(nèi)解體不是因為自身化學(xué)穩(wěn)定性差或非特異性切割，作者將THR響應(yīng)性的AuNC-P1₂₀-NAv復(fù)合物注射到荷瘤和健康小鼠體內(nèi)，結(jié)果表明，與健康小鼠相比，荷瘤小鼠的尿液樣本中沒有產(chǎn)生任何顯著的比色信號（圖5e）。因此，AuNC-NAv納米傳感器僅對體內(nèi)疾病的特異性蛋白裂解活動做出反應(yīng)，并能夠通過比色直接讀出疾病狀態(tài)。

圖5 蛋白酶響應(yīng)性納米傳感器通過比色尿

直接讀出疾病狀態(tài)

總之，作者開發(fā)了一種通過比色尿來檢測疾病狀態(tài)的方法，該方法快速、簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)。所設(shè)計的響應(yīng)性納米傳感器可用于快速檢測各種與疾病相關(guān)的蛋白酶，包括那些與傳染病有關(guān)的酶，從而使人們快速、準(zhǔn)確的獲得診斷信息。

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