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骨腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和腫瘤切除后繼發(fā)骨缺損是臨床醫(yī)生面臨的棘手問題。同時(shí)具有腫瘤消融和誘導(dǎo)骨再生能力的多功能生物療修材料(兼具治療和修復(fù)功能)有望開發(fā)用于臨床骨腫瘤治療。二維碳化鈮(Nb₂C) MXene具有良好的生物相容性和生物可降解性，在第二近紅外(NIR-II)生物窗口中具有固有的光響應(yīng)和光熱轉(zhuǎn)換性能。本工作將2D Nb₂C MXenes整合到3D多孔生物玻璃支架中，實(shí)現(xiàn)了光熱熱療殺死骨腫瘤細(xì)胞及血管化驅(qū)動(dòng)新骨形成的多重功能，為骨腫瘤治療提供了一種新型生物療修支架材料。

本文亮點(diǎn)

1. 采用2D碳化鈮MXene納米片復(fù)合3D打印生物玻璃支架，實(shí)現(xiàn)兼具光熱治療和骨修復(fù)功能的生物復(fù)合支架材料的制備。

2. 該生物復(fù)合支架材料實(shí)現(xiàn)了NIR-II生物窗下骨肉瘤的高效光熱消融。

3. 該生物復(fù)合支架材料具備良好的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，能夠驅(qū)動(dòng)缺損部位血管化并促進(jìn)骨再生。

內(nèi)容簡介

早期手術(shù)切除和化療是治療骨腫瘤的常用方法，但預(yù)防復(fù)發(fā)和填補(bǔ)切除部位引起的骨缺損仍具有較高的挑戰(zhàn)性。上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院高俊杰，張長青等；上海大學(xué)陳雨等在本文中報(bào)道了一種近紅外光激發(fā)的二維超薄碳化鈮MXene納米片復(fù)合到3D打印的生物玻璃支架(NBGS)用于治療骨肉瘤的方法。集成的2D Nb₂C-MXene在第二近紅外(NIR-II)生物窗中具有光響應(yīng)及較高的組織穿透深度，使其能夠有效殺傷骨癌細(xì)胞。此外，該材料能明顯促進(jìn)血管新生。支架降解過程中釋放的鈣和磷酸鹽可以促進(jìn)新骨組織的礦化。具有殺傷骨腫瘤細(xì)胞、促進(jìn)血管新生和骨再生等多種功能的碳化鈮MXene復(fù)合支架是一種對(duì)骨腫瘤有較好療效的植入性生物療修材料。

圖文導(dǎo)讀

I 2D Nb₂C MXene NSs的合成與表征

采用化學(xué)剝離法制備2D Nb₂C MXene NSs。SEM圖像顯示，固相燒結(jié)制備的Nb₂AlC陶瓷(MAX相)具有致密的層狀組織。如圖1所示，SEM圖像和對(duì)應(yīng)的元素含量表明，該MAX相陶瓷為Nb、Al和C三元化合物(圖1b)。用HF處理后，形成了多層結(jié)構(gòu)(MXene)，Al含量明顯降低(圖1d)。經(jīng)過TPAOH的進(jìn)一步插入，得到了少層的Nb₂C NSs。與Nb₂AlC相比，Nb₂C NSs中Nb元素的信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，而Al元素的信號(hào)強(qiáng)度降低。與XPS數(shù)據(jù)一致，拉曼光譜顯示元素Al在Nb₂C中的NSs比Nb₂AlC粉中的損失顯著。經(jīng)過HF和TPAOH處理后，Nb₂CNSs顯示出層狀結(jié)構(gòu)。

圖1. 超薄2D Nb₂C MXene NSs的制備與表征。(a-b) Nb₂AlC陶瓷對(duì)應(yīng)元素(Nb、Al和C)的SEM圖像；(c-d) 多層Nb₂CMXene及其對(duì)應(yīng)元素(Nb、Al和C)的SEM圖像；(e) 超薄Nb₂C MXene NSs的TEM圖像；(f) Nb₂AlC和Nb₂CNSs的X射線光電子能譜(XPS)；(g) Nb₂AlC體和Nb₂C NSs的拉曼光譜。

II 3D NBGS的合成與表征

直觀上看，從BGS、0.25 NBGS、0.5 NBGS到1.0 NBGS，支架的顏色由白色逐漸變?yōu)楹谏�，但在Nb₂C NSs改性過程中，其3D清晰的微孔結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。此外，隨著Nb₂C NSs濃度的升高，Nb₂C NSs在NBGS表面相應(yīng)增加，而微孔減少。NBGS的截面形貌和放大的界面SEM圖像表明Nb₂C NSs和BGS的成功整合。

圖2. 3D NBGS的合成與表征。(a-d) 具有三維幾何結(jié)構(gòu)的BGS和NBGS的數(shù)碼照片；(e-p) 不同放大率的SEM圖像；(q) BGS和NBGS的XRD譜圖；(r) BGS和NBGS的XPS譜；(s) BGS和NBGS的拉曼光譜。

III NBGS的光熱特性和抗腫瘤性能將NBGS用于體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)獲得了較好的效果。支架植入后24小時(shí)在腫瘤部位進(jìn)行NIR-II (1064 nm激光)光觸發(fā)熱消融。近紅外照射3 min內(nèi)，異種移植物表面溫度升高至~56℃，明顯高于對(duì)照組(~40℃)。次日，對(duì)隨機(jī)采集的各組腫瘤標(biāo)本進(jìn)行H&E、TUNEL和Ki-67染色，觀察骨肉瘤消融效果。TUNEL和H&E染色顯示BGS組、BGS+NIR組、NBGS組凋亡腫瘤細(xì)胞較少，而NBGS+NIR組可見明顯的核解離，腫瘤細(xì)胞大量死亡。Ki-67染色也支持TUNEL和H&E染色結(jié)果。這些結(jié)果表明，NBGS可以有效殺死腫瘤細(xì)胞。為了評(píng)價(jià)NBGS的急性毒性作用，在激光照射后24 h取小鼠主要器官進(jìn)行H&E染色。治療組和對(duì)照組均未出現(xiàn)明顯的炎癥浸潤或其他病理異常，說明NBGS用于光熱骨腫瘤消融具有良好的生物安全性。

圖3. BGS/NBGS的光熱特性及抗腫瘤性能。(a) PBS中1.0NBGS和BGS的溫度變化曲線；(b) 不同處理后Saos-2細(xì)胞的相對(duì)活性；(c) 不同處理組Calcein-AM/PI染色；(d) 腫瘤組織的H&E、TUNEL和Ki-67染色圖像；(e) 植入1.0 NBGS和BGS的小鼠模型在NIR-II激光照射后的溫度曲線；(f) 不同治療方案荷瘤小鼠的腫瘤體積；(g) 荷瘤小鼠體重；(h) 不同治療組小鼠的生存曲線。

IV NBGS在體內(nèi)和體外均可刺激血管新生

血管在骨修復(fù)的整個(gè)過程中起著至關(guān)重要的作用。血管新生與骨形成密切相關(guān)。當(dāng)骨缺損發(fā)生時(shí)，成骨前體細(xì)胞通過新生血被管募集到損傷處參與成骨。該工作在體外及體內(nèi)分析了BGS和NBGS促進(jìn)血管形成方面的差異(如圖4所示)。劃痕實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NBGS顯著提高了HUEVCs的遷移能力。成管實(shí)驗(yàn)可見NBGS組分支數(shù)更多。為了闡明NBGS促進(jìn)血管形成的機(jī)制，我們采用QPCR方法檢測了成管相關(guān)基因的表達(dá)。與BGS組相比，NBGS可以持續(xù)促進(jìn)VEGF-B和FGF2的表達(dá)，表明NBGS具有更好的促進(jìn)血管生成的功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將NBGS植入大鼠顱骨缺損處3周后，通過Microfil灌注觀察支架周圍的血管新生情況。實(shí)驗(yàn)可見圍繞NBGS有更密集的血管網(wǎng)絡(luò)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外結(jié)果一致。結(jié)果證明：從NBGS中釋放的Nb可刺激血管化，是促進(jìn)成骨耦合的理想元素。

圖4. BGS和NBGS在體內(nèi)外刺激血管新生。(a) 劃痕實(shí)驗(yàn)；(b) 遷移實(shí)驗(yàn)；(c) 增殖實(shí)驗(yàn)；(d-f) 成管效果分析；(j-n) 體內(nèi)植入支架的三維重建圖像；(o) 新生血管定量分析。

V NBGS在體外及體內(nèi)成骨療效評(píng)價(jià)

羥基磷灰石在間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)增殖和成骨分化中發(fā)揮重要作用。Ca/P比值越接近羥基磷灰石組成，礦化能力越強(qiáng)。NBGS的Ca/P比值有利于MSC成骨分化和新生骨礦化，在體內(nèi)具有更好的促進(jìn)骨再生性能。與NBGS共培養(yǎng)的hBMSCs增殖更好。此外，細(xì)胞中成骨相關(guān)基因COL1、OCN和OPN的表達(dá)顯著上調(diào)。茜素紅染色結(jié)果與QPCR結(jié)果一致。因此，NBGS具有良好的生物活性、生物相容性和誘導(dǎo)成骨性能，可作為驅(qū)動(dòng)骨再生的良好生物材料。SD大鼠骨缺損模型是目前研究骨缺損再生最常用的模型之一。通過構(gòu)建SD大鼠顱骨骨缺損模型，植入NBGS和BGS后利用micro-CT評(píng)估NBGS促進(jìn)骨再生的效果。結(jié)果表明NBGS促進(jìn)骨新生能力明顯高于BGS組。

圖5. BGS/NBGS對(duì)成骨的影響。(a) 與BGS/NBGS共培養(yǎng)的hBMSCs的共聚焦圖像；(b) 對(duì)照組、BGS組和NBGS組hBMSCs成骨基因(COL1、RUNX2、OCN、OPN)表達(dá)；(c) 茜素紅染色；(d-l) micro-CT評(píng)估各組骨再生情況。

通過熒光三色實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠顱骨修復(fù)進(jìn)一步評(píng)估(如圖6所示)。與BGS組相比，NBGS支架表現(xiàn)出更好的誘導(dǎo)骨再生性能。通過H&E染色和Masson染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)植入NBGS的骨缺損處有大量礦化骨組織，且未見明顯殘留支架。此外，Goldner染色顯示，BGS組的缺損區(qū)在殘余材料周圍有新的類骨質(zhì)(紅色組織)混合物，而NBGS周圍骨組織已經(jīng)大量礦化成熟(綠色組織)。這一結(jié)果表明該支架具有良好的骨再生和降解能力。

圖6. 新生骨熒光成像和組織學(xué)染色。(a-e) 第2、4、6周皮下注射鹽酸四環(huán)素(藍(lán)色熒光)、鈣黃綠素AM(綠色熒光)和茜素紅(紅色熒光)，不同顏色的熒光代表不同時(shí)間的新生骨組織；(f-k) H&E染色、Masson染色及Goldner染色。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新骨沿支架孔隙長入(如圖7所示)。這些結(jié)果表明在體內(nèi)材料引導(dǎo)下骨再生良好，具有良好的骨傳導(dǎo)性。圖7g-i展示了不同時(shí)期新骨組織形成的過程。第8周時(shí)大量成纖維細(xì)胞分布在支架間隙。16周時(shí)支架生物降解伴隨紅色類骨質(zhì)逐漸填充，展現(xiàn)了NBGS組的骨形成和支架降解過程的協(xié)同進(jìn)行。前述研究證實(shí)了Nb₂C可以明顯促進(jìn)血管形成，通過豐富的血運(yùn)可聚集更多的免疫細(xì)胞在缺陷部位周圍，加速NBGS的降解。此外，大量的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過新生血管運(yùn)往骨缺損部位，促進(jìn)骨再生。NBGS的降解為骨重建提供了足夠的空間。支架降解過程中釋放的鈣和磷酸鹽可以促進(jìn)新骨組織的礦化。與之相比，對(duì)照組因?yàn)樾律�血管稀少，原料供�?yīng)不足，顯著減緩了BGS支架的降解速度。

圖7. 材料引導(dǎo)的體內(nèi)骨組織再生。(a-d) 缺損區(qū)新生骨共聚焦成像；(e) microCT橫切面成像；(f) 第8周NBGS組的Goldner染色；(g-i) 第8、16、24周NBGS組Goldner染色。

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