骨腫瘤療修的生物玻璃支架材料：3D打印超薄二維碳化鈮MXene納米片
骨腫瘤術后復發和腫瘤切除后繼發骨缺損是臨床醫生面臨的棘手問題。同時具有腫瘤消融和誘導骨再生能力的多功能生物療修材料(兼具治療和修復功能)有望開發用于臨床骨腫瘤治療。二維碳化鈮(Nb₂C) MXene具有良好的生物相容性和生物可降解性，在第二近紅外(NIR-II)生物窗口中具有固有的光響應和光熱轉換性能。本工作將2D Nb₂C MXenes整合到3D多孔生物玻璃支架中，實現了光熱熱療殺死骨腫瘤細胞及血管化驅動新骨形成的多重功能，為骨腫瘤治療提供了一種新型生物療修支架材料。
本文亮點
1. 采用2D碳化鈮MXene納米片復合3D打印生物玻璃支架，實現兼具光熱治療和骨修復功能的生物復合支架材料的制備。
2. 該生物復合支架材料實現了NIR-II生物窗下骨肉瘤的高效光熱消融。
3. 該生物復合支架材料具備良好的骨傳導性和骨誘導性，能夠驅動缺損部位血管化并促進骨再生。
內容簡介
早期手術切除和化療是治療骨腫瘤的常用方法，但預防復發和填補切除部位引起的骨缺損仍具有較高的挑戰性。上海交通大學附屬第六人民醫院高俊杰，張長青等；上海大學陳雨等在本文中報道了一種近紅外光激發的二維超薄碳化鈮MXene納米片復合到3D打印的生物玻璃支架(NBGS)用于治療骨肉瘤的方法。集成的2D Nb₂C-MXene在第二近紅外(NIR-II)生物窗中具有光響應及較高的組織穿透深度，使其能夠有效殺傷骨癌細胞。此外，該材料能明顯促進血管新生。支架降解過程中釋放的鈣和磷酸鹽可以促進新骨組織的礦化。具有殺傷骨腫瘤細胞、促進血管新生和骨再生等多種功能的碳化鈮MXene復合支架是一種對骨腫瘤有較好療效的植入性生物療修材料。
圖文導讀
I 2D Nb₂C MXene NSs的合成與表征
采用化學剝離法制備2D Nb₂C MXene NSs。SEM圖像顯示，固相燒結制備的Nb₂AlC陶瓷(MAX相)具有致密的層狀組織。如圖1所示，SEM圖像和對應的元素含量表明，該MAX相陶瓷為Nb、Al和C三元化合物(圖1b)。用HF處理后，形成了多層結構(MXene)，Al含量明顯降低(圖1d)。經過TPAOH的進一步插入，得到了少層的Nb₂C NSs。與Nb₂AlC相比，Nb₂C NSs中Nb元素的信號強度顯著增強，而Al元素的信號強度降低。與XPS數據一致，拉曼光譜顯示元素Al在Nb₂C中的NSs比Nb₂AlC粉中的損失顯著。經過HF和TPAOH處理后，Nb₂CNSs顯示出層狀結構。
圖1. 超薄2D Nb₂C MXene NSs的制備與表征。(a-b) Nb₂AlC陶瓷對應元素(Nb、Al和C)的SEM圖像；(c-d) 多層Nb₂CMXene及其對應元素(Nb、Al和C)的SEM圖像；(e) 超薄Nb₂C MXene NSs的TEM圖像；(f) Nb₂AlC和Nb₂CNSs的X射線光電子能譜(XPS)；(g) Nb₂AlC體和Nb₂C NSs的拉曼光譜。
II 3D NBGS的合成與表征
直觀上看，從BGS、0.25 NBGS、0.5 NBGS到1.0 NBGS，支架的顏色由白色逐漸變為黑色，但在Nb₂C NSs改性過程中，其3D清晰的微孔結構沒有發生變化。此外，隨著Nb₂C NSs濃度的升高，Nb₂C NSs在NBGS表面相應增加，而微孔減少。NBGS的截面形貌和放大的界面SEM圖像表明Nb₂C NSs和BGS的成功整合。
圖2. 3D NBGS的合成與表征。(a-d) 具有三維幾何結構的BGS和NBGS的數碼照片；(e-p) 不同放大率的SEM圖像；(q) BGS和NBGS的XRD譜圖；(r) BGS和NBGS的XPS譜；(s) BGS和NBGS的拉曼光譜。
III NBGS的光熱特性和抗腫瘤性能將NBGS用于體內抗腫瘤實驗獲得了較好的效果。支架植入后24小時在腫瘤部位進行NIR-II (1064 nm激光)光觸發熱消融。近紅外照射3 min內，異種移植物表面溫度升高至~56℃，明顯高于對照組(~40℃)。次日，對隨機采集的各組腫瘤標本進行H&E、TUNEL和Ki-67染色，觀察骨肉瘤消融效果。TUNEL和H&E染色顯示BGS組、BGS+NIR組、NBGS組凋亡腫瘤細胞較少，而NBGS+NIR組可見明顯的核解離，腫瘤細胞大量死亡。Ki-67染色也支持TUNEL和H&E染色結果。這些結果表明，NBGS可以有效殺死腫瘤細胞。為了評價NBGS的急性毒性作用，在激光照射后24 h取小鼠主要器官進行H&E染色。治療組和對照組均未出現明顯的炎癥浸潤或其他病理異常，說明NBGS用于光熱骨腫瘤消融具有良好的生物安全性。
圖3. BGS/NBGS的光熱特性及抗腫瘤性能。(a) PBS中1.0NBGS和BGS的溫度變化曲線；(b) 不同處理后Saos-2細胞的相對活性；(c) 不同處理組Calcein-AM/PI染色；(d) 腫瘤組織的H&E、TUNEL和Ki-67染色圖像；(e) 植入1.0 NBGS和BGS的小鼠模型在NIR-II激光照射后的溫度曲線；(f) 不同治療方案荷瘤小鼠的腫瘤體積；(g) 荷瘤小鼠體重；(h) 不同治療組小鼠的生存曲線。
IV NBGS在體內和體外均可刺激血管新生
血管在骨修復的整個過程中起著至關重要的作用。血管新生與骨形成密切相關。當骨缺損發生時，成骨前體細胞通過新生血被管募集到損傷處參與成骨。該工作在體外及體內分析了BGS和NBGS促進血管形成方面的差異(如圖4所示)。劃痕實驗和遷移實驗結果表明，NBGS顯著提高了HUEVCs的遷移能力。成管實驗可見NBGS組分支數更多。為了闡明NBGS促進血管形成的機制，我們采用QPCR方法檢測了成管相關基因的表達。與BGS組相比，NBGS可以持續促進VEGF-B和FGF2的表達，表明NBGS具有更好的促進血管生成的功能。體內實驗中，將NBGS植入大鼠顱骨缺損處3周后，通過Microfil灌注觀察支架周圍的血管新生情況。實驗可見圍繞NBGS有更密集的血管網絡。體內實驗與體外結果一致。結果證明：從NBGS中釋放的Nb可刺激血管化，是促進成骨耦合的理想元素。
圖4. BGS和NBGS在體內外刺激血管新生。(a) 劃痕實驗；(b) 遷移實驗；(c) 增殖實驗；(d-f) 成管效果分析；(j-n) 體內植入支架的三維重建圖像；(o) 新生血管定量分析。
V NBGS在體外及體內成骨療效評價
羥基磷灰石在間充質干細胞(MSC)增殖和成骨分化中發揮重要作用。Ca/P比值越接近羥基磷灰石組成，礦化能力越強。NBGS的Ca/P比值有利于MSC成骨分化和新生骨礦化，在體內具有更好的促進骨再生性能。與NBGS共培養的hBMSCs增殖更好。此外，細胞中成骨相關基因COL1、OCN和OPN的表達顯著上調。茜素紅染色結果與QPCR結果一致。因此，NBGS具有良好的生物活性、生物相容性和誘導成骨性能，可作為驅動骨再生的良好生物材料。SD大鼠骨缺損模型是目前研究骨缺損再生最常用的模型之一。通過構建SD大鼠顱骨骨缺損模型，植入NBGS和BGS后利用micro-CT評估NBGS促進骨再生的效果。結果表明NBGS促進骨新生能力明顯高于BGS組。
圖5. BGS/NBGS對成骨的影響。(a) 與BGS/NBGS共培養的hBMSCs的共聚焦圖像；(b) 對照組、BGS組和NBGS組hBMSCs成骨基因(COL1、RUNX2、OCN、OPN)表達；(c) 茜素紅染色；(d-l) micro-CT評估各組骨再生情況。
通過熒光三色實驗對大鼠顱骨修復進一步評估(如圖6所示)。與BGS組相比，NBGS支架表現出更好的誘導骨再生性能。通過H&E染色和Masson染色結果發現植入NBGS的骨缺損處有大量礦化骨組織，且未見明顯殘留支架。此外，Goldner染色顯示，BGS組的缺損區在殘余材料周圍有新的類骨質(紅色組織)混合物，而NBGS周圍骨組織已經大量礦化成熟(綠色組織)。這一結果表明該支架具有良好的骨再生和降解能力。
圖6. 新生骨熒光成像和組織學染色。(a-e) 第2、4、6周皮下注射鹽酸四環素(藍色熒光)、鈣黃綠素AM(綠色熒光)和茜素紅(紅色熒光)，不同顏色的熒光代表不同時間的新生骨組織；(f-k) H&E染色、Masson染色及Goldner染色。
動物實驗發現新骨沿支架孔隙長入(如圖7所示)。這些結果表明在體內材料引導下骨再生良好，具有良好的骨傳導性。圖7g-i展示了不同時期新骨組織形成的過程。第8周時大量成纖維細胞分布在支架間隙。16周時支架生物降解伴隨紅色類骨質逐漸填充，展現了NBGS組的骨形成和支架降解過程的協同進行。前述研究證實了Nb₂C可以明顯促進血管形成，通過豐富的血運可聚集更多的免疫細胞在缺陷部位周圍，加速NBGS的降解。此外，大量的營養物質、氧氣和骨髓間充質干細胞通過新生血管運往骨缺損部位，促進骨再生。NBGS的降解為骨重建提供了足夠的空間。支架降解過程中釋放的鈣和磷酸鹽可以促進新骨組織的礦化。與之相比，對照組因為新生血管稀少，原料供應不足，顯著減緩了BGS支架的降解速度。
圖7. 材料引導的體內骨組織再生。(a-d) 缺損區新生骨共聚焦成像；(e) microCT橫切面成像；(f) 第8周NBGS組的Goldner染色；(g-i) 第8、16、24周NBGS組Goldner染色。
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