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【摘要】

作為生物材料的重要組成部分，膠原蛋白為組織工程中的細胞粘附和增殖提供了三維支架和生物學線索。最初在化膿性鏈球菌中發現并在異源宿主中產生的重組膠原蛋白樣蛋白已被化學和基因工程改造用于生物材料應用。然而，現有的類膠原蛋白不形成凝膠，限制了它們作為生物材料的實用性。

最近，江南大學許菲教授團隊提出了一系列合理設計的類膠原蛋白，由三聚化結構域、不同長度的三螺旋結構域和一對作為粘合末端連接到 N 和 C 末端的異源三聚體卷曲螺旋序列組成。這些設計的蛋白質折疊成三重螺旋并形成自支撐凝膠。隨著三螺旋域的延長，凝膠變得不那么硬，孔徑增加，結構各向異性降低。此外，細胞培養試驗證實設計的蛋白質是無細胞毒性的。這項研究為基于膠原蛋白的生物材料提供了一種設計策略。序列變化揭示了蛋白質一級結構和材料特性之間的關系，其中交聯密度和結合能的變化定義了蛋白質網絡的凝膠化。相關論文以題為Design Strategies to Tune the Structural and Mechanical Properties of Synthetic Collagen Hydrogels發表在《生物大分子》上。

圖 1. 蛋白質的設計策略和驗證。測試了三種設計：E3-VB-K3、E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3。蛋白質的 (A) 序列和 (B) 二級結構的示意圖。(C) 提出的分子間關聯和自組裝機制。凝膠電泳表征 (D) 用 NcoI 和 BamHI 酶消化重組質粒后核苷酸片段的長度和 (E) 蛋白質的分子量。(F-I) 基質輔助激光解吸電離飛行時間 (MALDI-TOF) 質譜法表征蛋白質的分子量。

圖 2. 凝膠結構。(A-D) E3-VB-K3 的凝膠化通過倒置小瓶和鑷子操作來測試。凍干后，凝膠的微觀結構被切成 (B, C) 縱向和 (D) 橫截面，并用掃描電子顯微鏡 (SEM) 觀察。(E-H) E3-VBB-K3 的小瓶倒置測試和 SEM，具有 (F, G) 縱向和 (H) 橫截面，以及 (I-L) E3-VBBB-K3，具有 (J, K) 縱向和 (L) 橫向橫截面。由于 E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3 凝膠的硬度低，它們不能用鑷子處理。

圖 3. 蛋白質結構和穩定性。(A) CD 波長掃描和 (B) VB、E3-VB-K3、E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3 在 10 mM 磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 中 1 mg/mL 的熱變性曲線。

圖 4. 10 mM 中濃度為 10 mg/mL 的設計膠原蛋白 (A) VB、(B) E3-VB-K3、(C) E3-VBB-K3 和 (D) E3-VBBB-K3 的差示掃描量熱法 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）。

圖 5. 粒度分布。設計的膠原蛋白 (A) VB、(B) E3-VB-K3、(C) E3-VBB-K3 和 (D) E3-VBBB-的流體動力學半徑(Rh)分布的動態光散射 (DLS) 測量 K3 超過 48 小時。將樣品在 10 mM 磷酸鹽緩沖液中保持在 4 °C，濃度約為 1 mg/mL（pH 7.4）。每個子圖的插圖顯示主要 Rh 峰（> 5% 體積強度）隨時間的變化。在所有子圖中，不同時間的R_h分布曲線如右圖所示。

圖 6. 微流變學。(A, D) E3-VB-K3、(B, E) E3-VBB-K3 和 (C, F) E3-VBBB-K3 蛋白質溶液在 0.5 時的儲存和損失模量 G 和 G  和 1.6% (w/v) 在 10 mM 磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 中。頂行顯示濃度為 0.5%，底行顯示濃度為 1.6% (w/v)，但 E3-VBBB-K3 (F) 顯示為 1.16% (w/v) 的飽和濃度。

圖 7. 細胞在涂有設計膠原蛋白的板上鋪展。將 NIH/3T3 小鼠成纖維細胞接種并鋪展在涂有天然 I 型膠原蛋白（陽性對照）、VB、E3-VB-K3、E3-VBB-K3 和 E3-VBBB-K3 的組織培養板上，濃度為 1 、10 和 40 μg/mL，持續 24 小時。蛋白質名稱和濃度分別標記在圖的左側和頂部。細胞用 CFDA SE 和 Hoechst 染色，并用熒光顯微鏡觀察。比例尺代表所有圖像中的 100 μm。

圖 8. 由不同 (A) 濃度和 (B) 培養時間的設計蛋白質組成的底物上的相對細胞活力。樣品名稱標在右側。測試天然 I 型膠原蛋白（黑色）作為陽性對照。

團隊開發了通過蛋白質設計自組織成凝膠的重組膠原蛋白。膠原蛋白使用連接到 Scl2 片段的 α-螺旋粘性末端的嵌合體，重組表達使蛋白質材料的大規模和低成本生產成為可能。這些設計的蛋白質與天然膠原蛋白相比具有幾個優點，即批次間的一致性、易于遺傳操作，以及可用于承載賦予生物功能（如整合素結合）的序列的模塊化設計。細胞培養試驗證實凝膠無細胞毒性，使其可用于三維細胞培養。
細胞環境的結構和機械特性影響細胞活力和命運。通過修改蛋白質一級序列，團隊可以在嵌合設計中調整材料特性，例如孔徑、微觀結構的各向異性、凝膠強度和含水量。 E3-VB-K3 形成具有各向異性微觀結構的硬凝膠，由均勻的小孔組成。E3-VBBB-K3 形成了均勻的水凝膠，具有更多的多孔微結構和高 (> 98%) 的水含量。此外，觀察到的各向異性微結構通常與由分子間相互作用和外力（如磁場和機械拉伸）誘導的聚合物的順序組裝過程有關。團隊設計的具有加長三螺旋結構域的膠原蛋白似乎可以提高碰撞概率、加速組裝過程并破壞分子的單軸取向。在 DLS 中，E3-VB-K3 隨著時間的推移形成穩定的小顆粒和中等尺寸（~60 和~500 nm），而 E3-VBBB-K3 的粒徑增加，范圍從~300 到~3000 nm。

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