3D生物打印含血小板衍生物的顆粒狀水凝膠
組織是具有層次結(jié)構(gòu)的，由具有生物活性的動(dòng)態(tài)細(xì)胞外基質(zhì)和多個(gè)細(xì)胞群組成。細(xì)胞外基質(zhì)成分相互連接，以建立獨(dú)特的成分和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)上的支持以及調(diào)控細(xì)胞行為（如增殖、生長、遷移、分化）。此外，細(xì)胞外基質(zhì)還可以動(dòng)態(tài)地和局部地調(diào)節(jié)可溶性和固定化分子的釋放。水凝膠由于其水合網(wǎng)絡(luò)和獨(dú)特的理化性質(zhì)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，常被用做細(xì)胞外基質(zhì)的模擬物。微凝膠是一種通過自下而上工程策略制備的新型墨水。與傳統(tǒng)的塊狀水凝膠相比，微凝膠具有顯著的孔隙率、增加的比表面積、模塊化以及優(yōu)良的可控機(jī)械響應(yīng)。
近期，美國賓夕法尼亞大學(xué)生物工程系Jason A. Burdick教授團(tuán)隊(duì)將可光交聯(lián)的降冰片烯修飾的透明質(zhì)酸（NorHA）與人血小板裂解物（PL）結(jié)合起來，結(jié)合微流控技術(shù)制備了具有層次化纖維網(wǎng)絡(luò)的球形PL-NorHA微凝膠。這種微凝膠具有剪切變稀和自愈特性，可以通過3D打印技術(shù)制造穩(wěn)定的3D結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究論文：“Injectable hyaluronic acid and platelet lysate-derived granular hydrogels for biomedical applications”發(fā)表于Acta Biomaterialia上。
工藝：PL-NorHA水凝膠的合成：NorHA與PL基質(zhì)在室溫下孵育20min，然后可見光固化5min，以形成PL-NorHA水凝膠。
PL-NorHA微凝膠的制備：將前驅(qū)液1(NorHA或含凝血因子的NorHA)和前驅(qū)液2(PBS或PL)分別以1μl/min和2μl/min的流速導(dǎo)入微流控設(shè)備。在出口處(≈28 cm)，啟動(dòng)凝膠，然后經(jīng)可見光固化形成聚合物液滴。
1. PL-NorHA水凝膠的表征為了分析PL-NorHA水凝膠的纖維結(jié)構(gòu)，研究者將熒光纖維蛋白原加入PL溶液中，并用共聚焦顯微鏡觀察。圖2A-i,ii顯示，當(dāng)NorHA濃度為1%和2%時(shí)，水凝膠顯示出類似于典型的分層纖維基質(zhì)的相互連接和均勻的纖維結(jié)構(gòu)。這種多尺度屬性的引入重現(xiàn)了天然ECM從納米尺度到微米尺度的分級(jí)組織的復(fù)雜性。為了更好的了解所得水凝膠的凝膠動(dòng)力學(xué)和網(wǎng)絡(luò)特性，研究者分析了它們的凝膠過程和粘彈特性(圖2b-i~iv)。在可見光照射前(20min)，NorHA、NorHA蛋白(即不加凝血?jiǎng)?和PL-NorHA(即添加凝血?jiǎng)?具有較低的儲(chǔ)存模量，其機(jī)制相似(G’≈1-2Pa和G’’≈0.4-1Pa)。然而，當(dāng)暴露在可見光下時(shí)，由于硫醇-烯反應(yīng)的共價(jià)光交聯(lián)反應(yīng)，彈性模量和粘性模量增加，并在幾秒鐘內(nèi)達(dá)到儲(chǔ)存模量平臺(tái)(2b-i-iv)。PL-NorHA水凝膠(G’：593±156Pa-1wt.%和G’：3536±159Pa-2wt.%)比僅含NorHA(G’：1655±238Pa-1wt.%和G’：4845±376Pa-2wt.%)或含有蛋白質(zhì)的NorHA水凝膠(G’：1561±75Pa-1wt.%和G’：5324±722Pa-2wt.%)具有更低的儲(chǔ)能模量。
2. PL-NorHA水凝膠中蛋白質(zhì)的釋放HA的生物合成和組織周轉(zhuǎn)受合成酶和透明質(zhì)酸酶的調(diào)節(jié)。研究者利用對(duì)水凝膠中糖醛酸或總蛋白的量化，繪制了水凝膠的體外降解曲線(圖2C)。研究發(fā)現(xiàn)，在透明質(zhì)酸酶存在的情況下，水凝膠的總降解時(shí)間和降解速度更快。降解時(shí)間與交聯(lián)密度之間也存在相關(guān)性，高濃度(2wt.%)的降解速度慢于低濃度(1wt.%)。此外，PL-NorHA水凝膠的降解速度比NorHA快(圖2c- i,iii)。這是由于PL-NorHA水凝膠除了共價(jià)光交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)(NorHA)外，還含有交聯(lián)的PL蛋白結(jié)合的纖維基質(zhì)。因此，PL-NorHA水凝膠的降解不僅是由于糖醛酸的釋放（代表HA降解），也與纖維蛋白基質(zhì)的降解有關(guān)。1wt.%的PL-NorHA水凝膠(92±1%)比2wt.% PL-NorHA水凝膠(72±2%)具有更高的PL衍生蛋白釋放。這些結(jié)果表明，HA大分子濃度和纖維蛋白基質(zhì)的不同組合，可以調(diào)節(jié)載藥水凝膠中藥物的釋放。
4. 微凝膠的制備及表征將含有凝血因子的NorHA(凝血因子)和PL以不同的流量比通過兩個(gè)獨(dú)立的通道引入到Y(jié)形微流控芯片中，匯聚成一個(gè)層流的通道以促進(jìn)纖維蛋白的聚合。然后，這個(gè)單一通道被不相容的連續(xù)相截?cái)啵a(chǎn)生油包水液滴。經(jīng)過蛇形路徑時(shí)，纖維蛋白進(jìn)一步聚合，在通道末端經(jīng)可見光交聯(lián)，形成微凝膠（如圖4a）。研究者在微凝膠形成過程中摻入熒光素標(biāo)記的葡萄糖，以分析其形態(tài)（包括大小和圓度）(圖4b，c)。PL-NorHA微凝膠產(chǎn)生了均一和分層的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)(圖4b- ii)。球形微凝膠的平均直徑分別為120±12μm(1wt.%NorHA)、126±17μm(1wt.%PL-NorHA)、100±8μm(2 wt.%NorHA)和119±21μm(2 wt.%PL-NorHA)(圖4c-i,ii)。通過糖醛酸和總蛋白的釋放，研究者對(duì)微凝膠的降解進(jìn)行評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，微凝膠在透明質(zhì)酸酶存在時(shí)表現(xiàn)出降解趨勢(shì)，且濃度低的微凝膠比濃度高的微凝膠降解速度更快；PL-NorHA微凝膠的降解速度比NorHA微凝膠更快；微凝膠狀態(tài)的降解速度比水凝膠狀態(tài)更快(圖4d-i, iii)。對(duì)總蛋白釋放定量，發(fā)現(xiàn)7天后，在有或無透明質(zhì)酸酶的作用下，PL-NorHA的總蛋白釋放量分別為41%±7%和69%±3%。綜上研究表明，微凝膠的穩(wěn)定性和治療相關(guān)蛋白的釋放速率可以通過改變交聯(lián)密度以及透明質(zhì)酸酶濃度來調(diào)整。
5. 顆粒水凝膠的流變特性為了研究微凝膠的可打印性，研究者評(píng)估了微凝膠的流變特性和結(jié)構(gòu)(圖5)。振蕩剪切流變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)NorHA聚合物在微凝膠中的濃度從1%增加到2%時(shí)，顆粒水凝膠的儲(chǔ)存模量增加了一個(gè)數(shù)量級(jí)(圖5a-I, iv)。與在水凝膠中的觀察結(jié)果一致，PL的存在顯著降低了顆粒水凝膠的存儲(chǔ)模量(分別從77±3Pa降至234±2Pa，2wt.%NorHA和PL-NorHA)。微凝膠具有剪切稀釋性和自愈性的流變特性，可以在不改變初始性能的情況下以最小的力擠出。從不同濃度的微凝膠(1wt.%和2wt.%)制備的顆粒狀水凝膠都隨著應(yīng)變的增加而表現(xiàn)出剪切屈服(圖5a-ii，v)。通過一系列高(500%)和低(0.5%)應(yīng)變掃描，觀察到所有顆粒水凝膠的自恢復(fù)行為。在受到高應(yīng)變后，材料表現(xiàn)出快速的類固體行為恢復(fù)(圖5a-iii，vi)。為了更好地觀察顆粒水凝膠的結(jié)構(gòu)，研究者在制作油包水液滴前將微凝膠與羅丹明硫醇孵育以進(jìn)行可視化。結(jié)果表明，1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝膠顯示出非常小的孔隙率，而2wt.%PL-NorHA微凝膠增加了孔隙率，2wt.%NorHA微凝膠的孔隙率最大。這可能是由于微凝膠的粘彈性造成的。微凝膠的低力學(xué)擠壓增加了它們的堆積密度，且減小了表面積（圖5B）。
6. 3D打印顆粒水凝膠及其體外細(xì)胞響應(yīng)為了評(píng)估微凝膠墨水的可打印性，研究者將含有FITC-葡聚糖的微凝膠呈細(xì)絲狀打印在載玻片表面，并用熒光顯微鏡觀察(圖6a)。由于其顆粒狀結(jié)構(gòu)，微凝膠墨水很容易擠出形成均勻的細(xì)絲，呈現(xiàn)密集堆積的微凝膠形態(tài)。進(jìn)一步，研究者使用微凝膠墨水進(jìn)行3D打印以制造3D構(gòu)造(圖6b-i)。濃度較低的微凝膠墨水產(chǎn)生穩(wěn)定的3D結(jié)構(gòu)(圖6b-ii, iii, v)，濃度較高的NorHA微凝膠產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)容易破壞(圖6b-iv)。除了結(jié)構(gòu)的完整性，打印的結(jié)構(gòu)也顯示出高保真度。隨后研究者使用負(fù)載MSCs細(xì)胞的1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝膠進(jìn)行3D打印。生長在NorHA微凝膠上的MSCs顯示出圓形的形態(tài)(圖6c-i)，類似于NorHA水凝膠得到的結(jié)果；而PL-NorHA微凝膠中相互連接的微孔空間促進(jìn)了MSCs細(xì)胞的大量遷移與3D細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的形成(圖6c-i, iii)。這表明PL衍生蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞黏附和存活，并且可以形成可提供細(xì)胞錨點(diǎn)的分級(jí)纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)。
近期，美國賓夕法尼亞大學(xué)生物工程系Jason A. Burdick教授團(tuán)隊(duì)將可光交聯(lián)的降冰片烯修飾的透明質(zhì)酸（NorHA）與人血小板裂解物（PL）結(jié)合起來，結(jié)合微流控技術(shù)制備了具有層次化纖維網(wǎng)絡(luò)的球形PL-NorHA微凝膠。這種微凝膠具有剪切變稀和自愈特性，可以通過3D打印技術(shù)制造穩(wěn)定的3D結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究論文：“Injectable hyaluronic acid and platelet lysate-derived granular hydrogels for biomedical applications”發(fā)表于Acta Biomaterialia上。
圖1 PL-NorHA水凝膠和微凝膠的制備
凝膠材料：可光交聯(lián)的降冰片烯修飾的透明質(zhì)酸（NorHA）工藝：PL-NorHA水凝膠的合成：NorHA與PL基質(zhì)在室溫下孵育20min，然后可見光固化5min，以形成PL-NorHA水凝膠。
PL-NorHA微凝膠的制備：將前驅(qū)液1(NorHA或含凝血因子的NorHA)和前驅(qū)液2(PBS或PL)分別以1μl/min和2μl/min的流速導(dǎo)入微流控設(shè)備。在出口處(≈28 cm)，啟動(dòng)凝膠，然后經(jīng)可見光固化形成聚合物液滴。
1. PL-NorHA水凝膠的表征為了分析PL-NorHA水凝膠的纖維結(jié)構(gòu)，研究者將熒光纖維蛋白原加入PL溶液中，并用共聚焦顯微鏡觀察。圖2A-i,ii顯示，當(dāng)NorHA濃度為1%和2%時(shí)，水凝膠顯示出類似于典型的分層纖維基質(zhì)的相互連接和均勻的纖維結(jié)構(gòu)。這種多尺度屬性的引入重現(xiàn)了天然ECM從納米尺度到微米尺度的分級(jí)組織的復(fù)雜性。為了更好的了解所得水凝膠的凝膠動(dòng)力學(xué)和網(wǎng)絡(luò)特性，研究者分析了它們的凝膠過程和粘彈特性(圖2b-i~iv)。在可見光照射前(20min)，NorHA、NorHA蛋白(即不加凝血?jiǎng)?和PL-NorHA(即添加凝血?jiǎng)?具有較低的儲(chǔ)存模量，其機(jī)制相似(G’≈1-2Pa和G’’≈0.4-1Pa)。然而，當(dāng)暴露在可見光下時(shí)，由于硫醇-烯反應(yīng)的共價(jià)光交聯(lián)反應(yīng)，彈性模量和粘性模量增加，并在幾秒鐘內(nèi)達(dá)到儲(chǔ)存模量平臺(tái)(2b-i-iv)。PL-NorHA水凝膠(G’：593±156Pa-1wt.%和G’：3536±159Pa-2wt.%)比僅含NorHA(G’：1655±238Pa-1wt.%和G’：4845±376Pa-2wt.%)或含有蛋白質(zhì)的NorHA水凝膠(G’：1561±75Pa-1wt.%和G’：5324±722Pa-2wt.%)具有更低的儲(chǔ)能模量。
2. PL-NorHA水凝膠中蛋白質(zhì)的釋放HA的生物合成和組織周轉(zhuǎn)受合成酶和透明質(zhì)酸酶的調(diào)節(jié)。研究者利用對(duì)水凝膠中糖醛酸或總蛋白的量化，繪制了水凝膠的體外降解曲線(圖2C)。研究發(fā)現(xiàn)，在透明質(zhì)酸酶存在的情況下，水凝膠的總降解時(shí)間和降解速度更快。降解時(shí)間與交聯(lián)密度之間也存在相關(guān)性，高濃度(2wt.%)的降解速度慢于低濃度(1wt.%)。此外，PL-NorHA水凝膠的降解速度比NorHA快(圖2c- i,iii)。這是由于PL-NorHA水凝膠除了共價(jià)光交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)(NorHA)外，還含有交聯(lián)的PL蛋白結(jié)合的纖維基質(zhì)。因此，PL-NorHA水凝膠的降解不僅是由于糖醛酸的釋放（代表HA降解），也與纖維蛋白基質(zhì)的降解有關(guān)。1wt.%的PL-NorHA水凝膠(92±1%)比2wt.% PL-NorHA水凝膠(72±2%)具有更高的PL衍生蛋白釋放。這些結(jié)果表明，HA大分子濃度和纖維蛋白基質(zhì)的不同組合，可以調(diào)節(jié)載藥水凝膠中藥物的釋放。
圖2 PL-NorHA水凝膠的機(jī)械性能和降解性能表征 3. MSCs細(xì)胞對(duì)PL-NorHA水凝膠的體外反應(yīng)研究者將MSCs細(xì)胞在無血清條件下接種于NorHA、NorHA-RGD和PL-NorHA水凝膠上，體外培養(yǎng)4h和1d后觀察細(xì)胞形態(tài)。接種在NorHA水凝膠上的細(xì)胞通常表現(xiàn)出圓形形態(tài)，在1wt.%和2wt.%的濃度下有一些突起，隨著時(shí)間的推移顯示出可比的細(xì)胞鋪展面積和縱橫比(圖3a)。1wt.%和2wt.%NorHA-RGD組水凝膠可以極大的增加細(xì)胞鋪展面積。在PL-NorHA水凝膠(1wt.%和2wt.%)中細(xì)胞在培養(yǎng)僅4小時(shí)后就粘附、鋪展并呈現(xiàn)紡錘狀形態(tài)(圖3a，b)。培養(yǎng)1d后，MSCs呈細(xì)長突起，與相鄰細(xì)胞形成相互連接的網(wǎng)絡(luò)。這些變化可能是PL-NorHA水凝膠形成的纖維狀網(wǎng)絡(luò)造成的。它不僅提供了一個(gè)臨時(shí)的層次化的細(xì)胞外基質(zhì)，給予機(jī)械支持和細(xì)胞外基質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，而且還包含許多結(jié)合結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)與細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和生長因子之間相互作用。
圖3 PL-NorHA水凝膠的體外細(xì)胞活性評(píng)價(jià)
4. 微凝膠的制備及表征將含有凝血因子的NorHA(凝血因子)和PL以不同的流量比通過兩個(gè)獨(dú)立的通道引入到Y(jié)形微流控芯片中，匯聚成一個(gè)層流的通道以促進(jìn)纖維蛋白的聚合。然后，這個(gè)單一通道被不相容的連續(xù)相截?cái)啵a(chǎn)生油包水液滴。經(jīng)過蛇形路徑時(shí)，纖維蛋白進(jìn)一步聚合，在通道末端經(jīng)可見光交聯(lián)，形成微凝膠（如圖4a）。研究者在微凝膠形成過程中摻入熒光素標(biāo)記的葡萄糖，以分析其形態(tài)（包括大小和圓度）(圖4b，c)。PL-NorHA微凝膠產(chǎn)生了均一和分層的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)(圖4b- ii)。球形微凝膠的平均直徑分別為120±12μm(1wt.%NorHA)、126±17μm(1wt.%PL-NorHA)、100±8μm(2 wt.%NorHA)和119±21μm(2 wt.%PL-NorHA)(圖4c-i,ii)。通過糖醛酸和總蛋白的釋放，研究者對(duì)微凝膠的降解進(jìn)行評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，微凝膠在透明質(zhì)酸酶存在時(shí)表現(xiàn)出降解趨勢(shì)，且濃度低的微凝膠比濃度高的微凝膠降解速度更快；PL-NorHA微凝膠的降解速度比NorHA微凝膠更快；微凝膠狀態(tài)的降解速度比水凝膠狀態(tài)更快(圖4d-i, iii)。對(duì)總蛋白釋放定量，發(fā)現(xiàn)7天后，在有或無透明質(zhì)酸酶的作用下，PL-NorHA的總蛋白釋放量分別為41%±7%和69%±3%。綜上研究表明，微凝膠的穩(wěn)定性和治療相關(guān)蛋白的釋放速率可以通過改變交聯(lián)密度以及透明質(zhì)酸酶濃度來調(diào)整。
圖4PL-NorHA微凝膠的制備與表征
5. 顆粒水凝膠的流變特性為了研究微凝膠的可打印性，研究者評(píng)估了微凝膠的流變特性和結(jié)構(gòu)(圖5)。振蕩剪切流變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)NorHA聚合物在微凝膠中的濃度從1%增加到2%時(shí)，顆粒水凝膠的儲(chǔ)存模量增加了一個(gè)數(shù)量級(jí)(圖5a-I, iv)。與在水凝膠中的觀察結(jié)果一致，PL的存在顯著降低了顆粒水凝膠的存儲(chǔ)模量(分別從77±3Pa降至234±2Pa，2wt.%NorHA和PL-NorHA)。微凝膠具有剪切稀釋性和自愈性的流變特性，可以在不改變初始性能的情況下以最小的力擠出。從不同濃度的微凝膠(1wt.%和2wt.%)制備的顆粒狀水凝膠都隨著應(yīng)變的增加而表現(xiàn)出剪切屈服(圖5a-ii，v)。通過一系列高(500%)和低(0.5%)應(yīng)變掃描，觀察到所有顆粒水凝膠的自恢復(fù)行為。在受到高應(yīng)變后，材料表現(xiàn)出快速的類固體行為恢復(fù)(圖5a-iii，vi)。為了更好地觀察顆粒水凝膠的結(jié)構(gòu)，研究者在制作油包水液滴前將微凝膠與羅丹明硫醇孵育以進(jìn)行可視化。結(jié)果表明，1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝膠顯示出非常小的孔隙率，而2wt.%PL-NorHA微凝膠增加了孔隙率，2wt.%NorHA微凝膠的孔隙率最大。這可能是由于微凝膠的粘彈性造成的。微凝膠的低力學(xué)擠壓增加了它們的堆積密度，且減小了表面積（圖5B）。
圖5 PL-NorHA顆粒狀水凝膠的流變性和形態(tài)表征
6. 3D打印顆粒水凝膠及其體外細(xì)胞響應(yīng)為了評(píng)估微凝膠墨水的可打印性，研究者將含有FITC-葡聚糖的微凝膠呈細(xì)絲狀打印在載玻片表面，并用熒光顯微鏡觀察(圖6a)。由于其顆粒狀結(jié)構(gòu)，微凝膠墨水很容易擠出形成均勻的細(xì)絲，呈現(xiàn)密集堆積的微凝膠形態(tài)。進(jìn)一步，研究者使用微凝膠墨水進(jìn)行3D打印以制造3D構(gòu)造(圖6b-i)。濃度較低的微凝膠墨水產(chǎn)生穩(wěn)定的3D結(jié)構(gòu)(圖6b-ii, iii, v)，濃度較高的NorHA微凝膠產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)容易破壞(圖6b-iv)。除了結(jié)構(gòu)的完整性，打印的結(jié)構(gòu)也顯示出高保真度。隨后研究者使用負(fù)載MSCs細(xì)胞的1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝膠進(jìn)行3D打印。生長在NorHA微凝膠上的MSCs顯示出圓形的形態(tài)(圖6c-i)，類似于NorHA水凝膠得到的結(jié)果；而PL-NorHA微凝膠中相互連接的微孔空間促進(jìn)了MSCs細(xì)胞的大量遷移與3D細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的形成(圖6c-i, iii)。這表明PL衍生蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞黏附和存活，并且可以形成可提供細(xì)胞錨點(diǎn)的分級(jí)纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)。
圖6 3D打印結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及PL-NorHA微凝膠的體外細(xì)胞活性評(píng)價(jià)。
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