Advanced Science ：基于纏結(jié)微束型水凝膠的3D生物打印
基于擠出式的3D生物打印技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于創(chuàng)建多種功能組織類似結(jié)構(gòu)體，包括心肌、骨骼肌、肝臟、皮膚、骨骼和軟骨等。通常，生物墨水是由水凝膠前驅(qū)體制備得來(lái)的。通過(guò)改變水凝膠前驅(qū)體的流變特性，使得生物墨水在擠出時(shí)可作為連續(xù)的凝膠細(xì)絲沉積在支撐平臺(tái)上。與液體生物墨水相比，微凝膠生物墨水被認(rèn)為是一種新興的生物墨水，這種生物墨水具有固有的剪切變稀和剪切恢復(fù)特性。同時(shí)，由于微凝膠之間存在內(nèi)在空隙，與塊體凝膠材料相比，微凝膠生物墨水中的細(xì)胞具有更高的生存能力、擴(kuò)散和遷移能力。
近期，蘇黎世大學(xué)健康科學(xué)與技術(shù)系MarcyZenobi-Wong教授團(tuán)隊(duì)將塊狀水凝膠擠壓通過(guò)微米大小孔徑的網(wǎng)格，將水凝膠分解成微束型凝膠網(wǎng)絡(luò)。軟骨細(xì)胞與凝膠微束的共沉積3D生物打印形成的凝膠支架可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞形成豐富的細(xì)胞外基質(zhì)，使其壓縮模量得到顯著地提升。該研究中微束型水凝膠的構(gòu)建策略為3D打印生物墨水提供了一種新型的制備手段。相關(guān)研究論文：“3D Bioprinting of Macroporous Materials Based on Entangled Hydrogel Microstrands”發(fā)表于Advanced Science上。
圖1 纏結(jié)微束型凝膠網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及3D生物打印示意圖
凝膠材料：
甲基丙烯�；该髻|(zhì)酸（HA-MA）、甲基丙烯酰化明膠（GelMA）、明膠
工藝：
UV交聯(lián)HA-MA（濃度2%w/v，接枝率28%）或GelMA（濃度2%w/v，接枝率92%）/明膠塊體水凝膠通過(guò)孔洞為40~100μm的篩子進(jìn)行機(jī)械擠壓。這一過(guò)程將凝膠塊體分解成凝膠微束，這些微束隨機(jī)地相互纏繞，組成一種高縱橫比水凝膠組成的結(jié)構(gòu)化材料。
1. 纏結(jié)微束型凝膠的穩(wěn)定性和宏觀孔隙率：
為了研究3D打印纏結(jié)微束型凝膠的可調(diào)性，研究者通過(guò)調(diào)整UV交聯(lián)時(shí)間（20s、60s、180s）制備了一系列不同交聯(lián)強(qiáng)度的HA-MA體系凝膠。對(duì)比顆粒水凝膠，37℃下浸泡于PBS 7天中，塊體微凝膠在1h內(nèi)瓦解掉，而纏結(jié)微束型水凝膠在水介質(zhì)中具有長(zhǎng)期的凝聚力。為了評(píng)估HA-MA纏結(jié)微束型凝膠的孔隙率，研究者將凝膠浸入高分子量葡聚糖熒光染料中。由于葡聚糖的分子量較大，圖2H顯示出熒光標(biāo)記的葡聚糖只能進(jìn)入凝膠束之間，而無(wú)法穿透水凝膠的凝膠相，基于此，研究者可用來(lái)計(jì)算凝膠的孔隙率（圖2）。
圖2 纏結(jié)微束型凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性和宏觀孔隙率
2. HA-MA纏結(jié)微束型凝膠的剪切變稀及剪切恢復(fù)特性：
纏結(jié)微束型凝膠表現(xiàn)出剪切變稀的流變學(xué)特性，這是擠出式3D生物打印所必需的。通過(guò)流變學(xué)測(cè)定，不同交聯(lián)強(qiáng)度的HA-MA微束型凝膠的剪切恢復(fù)率不同，且隨著篩網(wǎng)孔徑的不同而改變，通過(guò)比對(duì)，研究者指出中等交聯(lián)強(qiáng)度的纏結(jié)微束型凝膠樣在初始剪切后的剪切恢復(fù)率為81.8% (篩網(wǎng)孔徑40 μm)和82% (篩網(wǎng)孔徑100 μm)，明顯優(yōu)于其他兩組，可作為優(yōu)良的3D打印生物墨水（圖3）。
圖3 HA-MA纏結(jié)微束型凝膠網(wǎng)絡(luò)的流變特性
3. 纏結(jié)微束型凝膠的3D打印特性：
基于HA-MA微束型凝膠，研究者3D生物打印出兩層網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。交聯(lián)率越高的凝膠樣品在較短的拉伸距離下越易斷裂，印刷精度也就越高。此外，考慮到纏結(jié)微束型水凝膠的流變學(xué)特性，中等交聯(lián)強(qiáng)度的纏結(jié)微束型凝膠樣是最優(yōu)良的生物墨水。兩種孔徑尺寸（40μm和100 μm）的流變性能和印刷性能沒(méi)有明顯差異，但孔徑尺寸對(duì)空隙率有顯著影響，因此可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用選擇該參數(shù)來(lái)調(diào)整凝膠的宏觀孔隙率。另外研究者還測(cè)試了其他水凝膠體系（GelMA、卡拉膠及酶或化學(xué)交聯(lián)的HA等），經(jīng)預(yù)交聯(lián)過(guò)濾形成微束型凝膠后，再進(jìn)行擠出式3D生物打印。測(cè)試結(jié)果表明所有的凝膠體系均可形成纏結(jié)的微絲并3D打印出網(wǎng)格支架。
圖4 纏結(jié)微束型凝膠的擠出式3D可打印性和各向異性
4. 負(fù)載細(xì)胞的纏結(jié)微束型凝膠的3D生物打�。�
研究者分別采用兩種方法探究纏結(jié)微束型凝膠的負(fù)載細(xì)胞能力：方法一，首先，細(xì)胞被嵌入到塊體水凝膠中，然后水凝膠被擠壓成凝膠微束；方法二，被擠壓成型的凝膠微束與細(xì)胞懸液混合，使細(xì)胞占據(jù)微束間的孔隙。采用方法一，研究者選擇明膠復(fù)合GelMA水凝膠探究纏結(jié)微束型凝膠負(fù)載小鼠成肌細(xì)胞（C2C12）的能力，鈣黃素AM染色結(jié)合Hoechst 染色顯示細(xì)胞融合并形成沿微絲方向排列的多核肌管（圖5）。采用方法二，研究者選擇HA-MA水凝膠微束和軟骨細(xì)胞復(fù)合，結(jié)果顯示軟骨細(xì)胞在3D生物打印后表現(xiàn)為圓形表型，但在培養(yǎng)7天和21天后增殖并顯示出更長(zhǎng)的梭型（圖6）。
圖5 纏結(jié)微束型凝膠可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞的肌管形成
圖6 纏結(jié)微束型凝膠負(fù)載軟骨細(xì)胞的高細(xì)胞活性3D打印
5. 體外負(fù)載軟骨細(xì)胞的纏結(jié)微束型凝膠誘導(dǎo)軟骨再生：
負(fù)載軟骨細(xì)胞的HA-MA纏結(jié)微束型凝膠培養(yǎng)42天后，凝膠塊呈白色軟骨狀，表明了致密的細(xì)胞外基質(zhì)沉積。為了證實(shí)這一點(diǎn)，研究者對(duì)培養(yǎng)的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行軟骨特異性標(biāo)志物染色，染色結(jié)果表明相關(guān)的蛋白多糖、Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原均得到高表達(dá)，其中Ⅱ型膠原在42天后，膠原染色增強(qiáng)，表現(xiàn)為微束內(nèi)沉積及水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的沉積。隨后，研究者對(duì)比了3D打印凝膠微束負(fù)載軟骨細(xì)胞培養(yǎng)21天及42天前后的壓縮模量，其模量由2.7 ± 0.3 kPa增加至212 ± 83.7 kPa，后增加至780.2 ± 218.4 kPa。雖然此機(jī)械強(qiáng)度遠(yuǎn)不及原生軟骨組織的壓縮模量（1829.8 ± 72 kPa），但仍是一個(gè)顯著的進(jìn)步。由于本研究中使用的材料本身的抗壓縮能力很小，壓縮模量的變化完全可以歸因于細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積和成熟（圖7）。
圖7 纏結(jié)微束型凝膠誘導(dǎo)軟骨再生
6. 總結(jié)：
該研究以高縱橫比水凝膠微束為生物墨水，該生物墨水中的凝膠微束相互纏結(jié)形成多孔且穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)。且該纏結(jié)微束型凝膠能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞的肌管形成，并維持相對(duì)較高的細(xì)胞活性（90%）。軟骨細(xì)胞與凝膠微束共沉積打印形成的凝膠支架可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞形成豐富的細(xì)胞外基質(zhì)，使其壓縮模量得到顯著地提升。該研究中微束型水凝膠的構(gòu)建策略為3D打印生物墨水提供了一種新型的制備手段。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1002/advs.202001419
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